圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸条的初步研制及应用

时建立，徐胜男，彭 喆，张玲玲，徐绍建，郑书轩，吴晓燕，于 江，孙文博，杜以军，吴家强，李 俊（.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 5000；.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 6609）



圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸条的初步研制及应用

时建立1，徐胜男1，彭 喆1，张玲玲2，徐绍建1，郑书轩2，吴晓燕1，于 江1，孙文博1，杜以军1，吴家强1，李 俊1
（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛 266109）

摘 要：为快速检测猪群中猪圆环病毒2型抗体，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，并标记纯化的猪圆环病毒Cap蛋白和兔IgG，包被至玻璃纤维膜上制备金标垫，将纯化抗原和羊抗兔IgG分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上，建立了检测猪圆环病毒2型抗体的胶体金免疫层析方法并组装检测卡。结果显示，组装的检测卡只与圆环病毒阳性血清发生特异性反应，阳性血清稀释10倍后仍然能够检出。用此检测卡与商品化ELISA试剂盒对100份临床血清进行平行检测，阳性率分别为89%和93%，两种方法符合率在95%以上。该方法操作简便、特异性强，可广泛应用于基层，也为圆环病毒疫苗效果评价提供了良好的试剂选择。

关键词：PCV2抗体；胶体金免疫层析；快速诊断

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是对猪群危害较严重的病毒性传染病［1］，在猪群病原中所占比例较高。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾炎综合征（PDNS）、幼龄仔猪的先天性震颤、猪呼吸道综合征、渗出性皮炎、繁殖障碍和增生性坏死性肺炎等。随着病毒基因组不断变异，病毒的致病性也在发生变化，对猪群的危害越来越大，严重影响养殖业的健康发展［2-4］。

目前，随着国内圆环病毒疫苗的上市，疫苗在规模化猪场的应用越来越广泛。由于不同厂家的疫苗质量参差不齐，所以对圆环病毒特异性抗体的检测显得尤为重要。目前检测PCV2抗体的方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验（IFA）等［5］。这些方法都需要昂贵的仪器设备、操作熟练的技术人员、较长的检测时间等，很难在基层推广。胶体金免疫层析技术做为一种快速、方便、特异的诊断方法，具有独特的应用优势。本研究应用实验室纯化的Cap蛋白，结合胶体金标记技术，研制了检测PCV2抗体的胶体金试纸条，为猪圆环病毒抗体的快速检测提供了候选方法。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料与仪器

Cap蛋白由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室截短表达纯化［6］。BSA购自Roche公司；氯金酸购自Sigma公司；硝酸纤维素膜（NC膜）、玻璃纤维膜、吸水纸、PVC板均购自上海金标生物技术有限公司；一次性无菌滤器（Millipore产品）；磁力搅拌器购自金坛市医疗仪器厂；胶体金点样系统（喷涂机）购自Bio Dot 公司；猪圆环病毒2型ELISA抗体试剂盒购自瑞普（保定）生物药业有限公司（批准文号：兽药生字（2010）030388095）。柠檬酸钠、氯化钠、碳酸钾均为常规分析纯试剂。

1.2 胶体金的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，步骤参照课题组发表文献［7］进行。

1.3 胶体金标记抗原标记量和标记pH值的选择

取25支洁净小试管，各加入1 mL胶体金，按表1所示正交表，用0.2M K2CO3调节pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0后，加入不同浓度纯化后的猪圆环病毒Cap蛋白50 μL，使其终浓度分别为5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL、12.5 μg/mL、15 μg/mL，混匀后室温静置反应15 min，然后向各管中加入100 μL 10%NaCl溶液，观察颜色变化，从而确定最佳的抗原标记量和标记pH值。

1.4 金标抗原的封闭和纯化

在确定最佳抗原标记量和标记PH值的金标溶液中加入兔IgG，使其终浓度为1 mg/mL，然后加入1/10体积的10%BSA溶液（终浓度1%）封闭，混匀并静置15 min，于4℃，8 000 rpm离心20 min，离心完全，上清清澈，弃上清后用原体积1/20且含有10%蔗糖的0.1M Tris-HCl（pH值8.5）储存液重新悬浮沉淀。

1.5 样品垫、金标结合垫与NC膜的预处理

将金标结合垫用Tween-20，样品垫、NC膜预用封闭液37℃浸泡处理30 min，然后用PBS溶液洗三次，37℃干燥备用。

1.6 喷膜

金标结合垫用喷膜仪将胶体金复合物以5 μL/cm的喷涂量喷金，干燥备用。将纯化后的猪圆环病毒Cap蛋白和羊抗兔IgG稀释到1mg/mL，按1μL /cm的量分别喷至NC膜的检测线（T-线）和对照线（C-线）上，37℃干燥备用。

1.7 免疫胶体金试纸条的简易组装

将处理好的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水垫以相应顺序粘贴在预先裁好的PVC胶板上：即结合垫叠加在NC膜上端，样品垫边缘附着在结合垫上，吸水垫边缘叠加在NC膜下端，彼此衔接紧密，裁剪制作试纸条，宽度为6 mm，组装胶体金检测卡备用。

1.8 特异性试验

分别取猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）阳性血清、猪圆环病毒2型（PCV2）阳性血清、猪瘟病毒（CSFV）阳性血清、猪伪狂犬病毒（PRV）阳性血清、猪流感病毒（SIV）阳性血清、乙脑病毒（JEV）阳性血清、猪细小病毒（PPV）阳性血清和猪口蹄疫病毒（FMDV）阳性血清滴加于已初步制备成的胶体金试纸条样品垫上，5～10 min内观察结果。

1.9 灵敏度试验

将猪圆环病毒2型阳性血清分别做2倍、4倍、6倍、8倍、10倍稀释，将组装好的免疫胶体金诊断试纸条平放在桌面上，向样品垫上滴加已稀释好的阳性血清样品，静置5～10 min后观察结果。

1.10 临床样品检测

共对临床送检的100份注射过PCV2灭活疫苗的血清样品分别用瑞普公司ELISA试剂盒和胶体金试纸条方法进行检测，对比两种方法的检测结果。

2 结果与分析

2.1 胶体金的选择

选用胶体金颗粒直径约为40 nm的胶体金，用紫外分光光度计测制备的胶体金在520 nm和535 nm处的吸光度值分别为0.94和0.89。

2.2 胶体金标记抗原标记量和标记pH值的确定

正交表的颜色变化如表1所示。

表1 不同PH值和抗原量标记胶体金时颜色变化情况

上述实验结果说明，饱和标记量为10 μg/mL，在标记pH为8.0条件下，金标抗原复合物结合稳定。

2.3 免疫胶体金试纸条的简易组装

将处理好的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水垫按照相应顺序粘贴在PVC胶板上，彼此连接紧密，组装胶体金检测卡，成品如图1所示。将组装好的试纸条用实验室保存的PCV2阳性血清进行检测验证，在T-线和C-线都出现特异性红棕色条带，检测结果为阳性（图2）。

图1 实验室初步组装的胶体金检测试纸条

图2 不同PCV2阳性血清的检测卡检测结果

2.4 特异性结果

分别取PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、SIV、JEV、PPV和FMDV阳性血清滴加于已初步制备成的胶体金试纸条样品垫上，5～10 min内观察结果。发现除了猪圆环病毒2型阳性血清试纸条的T-线和C-线出现两条特异性红棕色条带外，其余均只有C-线出现一条红棕色条带（图3），表明制备的胶体金试纸条有着很好的特异性。

图3 组装检测卡特异性试验检测结果

2.5 灵敏度试验结果

将组装好的免疫胶体金诊断试纸条平放在桌面上，向样品垫上滴加80 μL已稀释好的PCV2阳性血清样品B3和G5，结果显示，将阳性血清稀释10倍后此胶体金试纸条仍然能够检测出。

图4 组装检测卡灵敏性试验检测结果

2.6 临床样品检测结果

分别用ELISA和胶体金试纸条方法对临床送检的100份样品进行检测对比，分析结果发现，胶体金试纸条检测阳性数为89份，ELISA检测阳性数为93份，两种方法符合率在95%以上。虽然应用胶体金试纸条方法检测阳性率较ELISA方法略低，但是ELISA检测方法需要专门的仪器设备和技术人员，而且操作程序复杂、检测时间长，难以在基层推广应用。胶体金试纸条作为一种快速、简便的检测方法，无需专门人员培训，非常适合于基层推广应用。

3 讨论

目前我国大部分猪群中存在PCV2感染，同时PCV2常与多种病原混合感染猪，造成形式多样、病理复杂的临床症状。随着感染的病原不同，死亡率也有很大差异［7］。常规的抗原抗体检测方法主要是PCR和ELISA方法。这些方法在临床应用时有很大的局限性，而且随着商品化疫苗的使用，如何对疫苗效果进行快速检测评价成为广大养殖户面临的重要问题。因此，简便、快速、灵敏的圆环病毒抗体检测方法具有良好的应用前景。

胶体金免疫层析技术作为一种将胶体金标记、免疫检测和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术，具有操作简便、敏感、耗时短等优点［8］，现已广泛应用于激素或多种疾病相关蛋白检测、疫病病原抗原抗体检测、药物浓度检测、食品和环境中相关物质检测等多个方面［9］，在实际临床应用中具有广阔的前景。

本课题组曾经建立过检测圆环病毒抗体的葡萄球菌蛋白A（SPA）胶体金免疫层析方法［7］，其具有良好的灵敏性，但是SPA具有和人及多种动物（猪、兔、犬、小鼠、豚鼠）的IgG Fc片段结合的能力，使得建立的检测方法在特异性方面具有一定的局限性。本研究应用实验室纯化的PCV2 Cap蛋白抗原和成熟的胶体金标记技术建立了快速、简便检测PCV2抗体的胶体金免疫层析方法，成功组装试纸条。此方法与常用ELISA方法符合率在95%以上，而且此检测卡在金标液中使用双抗原，可使对照线更加明显。该方法具有较好的灵敏度和特异性，操作简便，可广泛应用于基层。

参考文献：

［1］Tischer I，Gelderblom H，Vettermann W，et al.A very small porcine virus with a circular single-stranded DNA ［J］.Nature，1982，295：64-66.

［2］Stevenson G W，Kiupel M，Mittal S K，et al.Tissue distribution and genetic typing of porcine circoviruses in pigs with naturally occurring congenital tremors ［J］.J Vet Diagn Invest，2001，13：57-62.

［3］Todd D，Niagro F，Richie B W，et al.Genome sequence determinations and analyses of novel circovirus from goose and pigeon ［J］.Virology，2001，286：354-362.

［4］Wattrang E，McNeilly F，Allan G M，et al.Exudative epidermitis and porcine circovirus-2 infection in a Swedish SPF-herd ［J］.Vet Microbiol，2002，86（4）：281-293.

［5］魏娟，李文刚，郑宝亮，等.猪圆环病毒2型诊断方法的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2008，35（3）：71-74.

［6］时建立，李俊，吴家强，等.PCV2 Rep、截短Cap蛋白原核表达条件的优化及纯化蛋白的免疫原性［J］.西北农业学报，2011，20（11）：22-24.

［7］时建立，战翔，李俊，等.SPA胶体金免疫层析方法检测PCV2 抗体的初步建立及应用［J］.中国动物检疫，2013，30 （9）：59-63.

［8］Chan C P，Cheung Y C，Renneberg R，et al.New trends in immunoassays［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，2008，109：123-154.

［9］Posthuma T G A，Korf J，Van A A.Lateral fl ow（immuno）assay：its strengths，weaknesses，opportunities and threats.A literature survey［J］.Anal Bioanal Chem，2009，393（2）：569-582.

（责任编辑：朱迪国）

Development and Application of Gold Immuno-chromatographic Assay for PCV2 Antibody Detection

Shi Jianli1，Xu Shengnan1，Peng Zhe1，Zhang Lingling2，Xu Shaojian1，Zheng Shuxuan2，Wu Xiaoyan1，Yu Jiang1，Sun Wenbo1，Du Yijun1，Wu Jiaqiang1，Li Jun1
（1.Research Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Shandong Academy of Agricultural Science，Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding，Jinan，Shandong 250100；2.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

Abstract ：To detect specifi c antibodies of porcine circovirus type 2（PCV2）with gold immuno-chromatographic assay，purifi ed PCV2 capid protein and rabbit IgG were labeled with colloidal gold prepared with the tri-sodium citrate reduction method，meanwhile capid protein and goat anti-rabbit IgG were striped in the test line position and quality control line position respectively.The results indicated that the assembled test card reacted exclusively with PCV2 positive sera and the test sensitivity was up-to 10 fold dilutions.The coincidence rate of this test card with commercial ELISA kid was up to 95%.The method was rapid，specifi c and simple in operation，and it could be extended at grass-roots.

Key words：porcine circovirus type 2 antibodies；colloidal gold immuno-chromatography；rapid diagnosis

中图分类号：S851.3

文献标识码：B

文章编号：1005-944X（2016）02-0073-04

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31201889）；山东省现代农业产业技术体系疫病控制岗位（SDAIT-06-021-07）；山东省科技发展计划（2014GNC111011）；山东省农业科学院青年科研基金项目（2014QNM40）

通讯作者：李 俊