一株野生乌芝的鉴定及其生物学特性研究

肖自添，刘 明，何焕清



一株野生乌芝的鉴定及其生物学特性研究

肖自添，刘 明，何焕清

（广东省农科院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州510640）

摘 要：从广东省广州市白云山内采集到一株野生假芝，对其子实体进行了组织分离，获得纯菌丝体。通过形态学和ITS序列鉴定，确认该菌株属于灵芝科假芝属真菌，与乌芝（Amauroderma rugosum）同源性最高，编号为白云乌芝（BYWZ）。首次开展乌芝生物学特性研究，结果表明，该菌株菌丝生长的最适碳源为果糖，最适氮源为麸皮，最适生长温度为30℃，最适pH值范围为7.0～8.0。该研究为乌芝的人工驯化栽培和开发利用奠定基础，对开发利用国内野生真菌资源具有重要意义。

关键词：野生假芝；鉴定；ITS序列；人工驯化

灵芝（Ganoderma lingzhi，旧称Ganoderma lucidum）作为“药用菌之王”，其保健、药用功效早已得到世界的认可。在我国已经有2000多年的记载和应用历史［1］，近年来，随着人们保健意识的增强，对灵芝产品的需求日益增加，其研究也日趋深入和广泛，使得灵芝已成为国内外学术界瞩目的研究课题［2-4］。“灵芝”其实是人们对灵芝科不同灵芝种属的一个统称，广义的灵芝包括灵芝科属的很多种类，目前已报道有超过250种［5］，分布在世界各地。假芝属是灵芝科的一个重要亚属，在灵芝科家族中占有一席之地，目前报道假芝属有22个种［6］，全部分布在热带、亚热带地区，其中皱盖假芝（Amauroderma rude）、乌芝（Amauroderma rugosum）、黑假芝（Amauroderma nigrum）、厦门假芝（Amauroderma amoiensis）等已经明确具有药用价值，在抗肿瘤、抗癌、抗氧化、消炎和提高免疫机能等方面起到积极作用［7-11］。但是，目前世界范围内对假芝属真菌的研究报道极少，与赤芝和紫芝相比相差甚远。最新的研究结果表明乌芝具有消炎、抗氧化、抑肿瘤等作用［8，12-13］，在马来西亚还作为一种传统的民间中草药用于治疗神经性癫痫等，在我国华南地区也有采摘、销售野生乌芝的传统习惯，不仅价格高，且常常供不应求。但是目前关于乌芝人工驯化栽培的报道极少，野生乌芝资源仍未被开发利用。本研究从广州市白云山采集分离得到一株野生假芝，经鉴定为具有药用价值的乌芝（Amauroderma rugosum），成功分离获得纯菌丝体，首次对其生物学特性进行研究，为乌芝的人工驯化栽培奠定基础，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株采集于广东省广州市白云山自然风景区内，经广东省农科院蔬菜研究所分离、纯化并保存，编号为BYWZ。PCR引物由上海英俊生物技术有限公司合成，DNA提取试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司。

母种培养基配方：去皮马铃薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、琼脂粉2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、VB1 0.003%，蒸馏水1 000 mL。用于组织分离和保藏。

碳源试验培养基：蛋白胨0.2%，琼脂2%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，VB1 0.003%，2%碳源，水1 000 mL。分别用2%葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、淀粉替代其中的碳。

氮源试验培养基：葡萄糖2%，琼脂2%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.15%，VB1 0.003%，0.2%氮源，水1 000 mL。分别用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、麸皮、豆粨粉、黄豆粉等有机氮和氯化铵、硫酸铵、硝酸铵等无机氮替代氮源。

温度试验培养基：同母种培养基。

pH值试验培养基：同母种培养基，并用1N盐酸和1N氢氧化钠调节培养基pH值。

1.2 菌种的分离与培养

产妇会阴完好率和产妇及其家属满意度两方面进行评定。产妇会阴完好情况分为会阴完好、会阴轻度损伤和损伤较严重,比较两组会阴完好率。产妇及其家属满意情况分为比较满意、一般满意和不满意,比较两组产妇及其家属满意度。在两组患者阴道分娩结束后,对两组产妇的产后恢复情况进行比较[3]。

采用组织分离法，在无菌条件下将经表面消毒的野生假芝鲜子实体用手术刀切开，在菌盖和菌柄交界处切取约0.2 cm2挑的组织块，接种于母种试管培养基中央，置于25（±1）℃的恒温培养箱中避光培养。获得菌丝体纯培养编号为BYWZ，长满后再转管1次，于4℃冰箱中保藏。

1.3 菌株的形态鉴定

采用插片培养法观察BYWZ菌株的菌丝形态。将经高压灭菌的培养基，在无菌条件下分装到直径9 mm的培养皿中，冷却，制备成固体平板。然后将活化好的菌种块（0.5 cm2）接入到平板中央，然后用镊子夹起一片已经高压灭菌的盖玻片以45°角插入平板中，培养皿封口后置于25（± 1）℃的恒温箱中培养。待菌丝长到盖玻片1/3处后将盖玻片取出，进行显微观察。

1.4 菌株的分子鉴定

1.4.1 DNA的提取 在无菌条件下将活化好的菌种接入已制备好的平板培养基中，25（±1）℃恒温培养箱避光培养，待菌丝长满培养皿后小心刮取菌丝体，-20℃保存，备用。

采用改良CTAB法提取总DNA。以0.7%琼脂糖凝胶检测DNA质量，用超微量紫外可见分光光度计检测DNA浓度及纯度。

1.4.2 ITS序列测定 PCR扩增反应在基因有限公司的Veriti型PCR扩增仪上进行，ITS-PCR反应体系（50 μL）为：基因组DNA 2 μL（模板），1×2 mmol/L dNTPs 5μL，25 mmol/L MgSO43 μL，正反引物（10 μmol/L）各1.5 μL（由上海英俊生物技术有限公司合成），2条引物分别为ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG），ITS4 （TCCTCCGCTTATTGATATGC），KOD-Plus-Neo （1 U/μL）1 μL（购自东洋纺生物科技有限公司），10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，补充ddH2O至50 μL。

1.4.3系统发育树构建 将菌株测序后的ITS基因序列提交到GenBank核酸序列数据库中，通过BLAST程序与GenBank和CBOL中的ITS基因序列进行同源性比较，利用MEGA 6.06软件，距离法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，Kimura2-parameter法计算遗传距离，重复抽样l 000次分析系统树各分支的置信度。

1.5 生物学特性研究

碳源、氮源、温度、pH试验均采用平板（直径为9 mm）培养方法，3次重复。无菌条件下在平板中央接种已活化的菌种块0.5 cm2，并在菌块下方划一刻度作为测量起始线，封口后置于25（± 1）℃恒温培养箱中避光培养。每天观察菌丝生长情况并划线，待其中一组长满平板即停止培养，并计算菌丝日均长速，菌丝生长速度=菌落半径增长度（mm）/培养时间（d）。温度试验置于不同温度培养箱进行避光培养。

试验数据采用Excel统计软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 子实体形态特征

供试菌株木栓质，为1年生担子果，菌盖肾形至近半圆形，直径3～10 cm，厚0.5～1.5 cm，灰褐色至黑色，被短绒毛，具显著同心环纹，无似漆样光泽，边缘钝、薄（图1A、C，封二）；菌管新鲜时白色，伤变血红色，然后迅速变黑色（图1B，封二）；菌柄偏生或侧生，圆柱形，实心，长4～12 cm，粗0.8～1.5 cm，与菌盖同色，有细微绒毛。结果与毕志树《广东大型真菌志》中假芝属真菌的子实体特征一致。

2.2 菌丝体形态特征

供试菌株的菌落初为白色，边缘规则，呈放射状向外扩张，致密（图2A，封二），随着培养时间的增加，菌落开始分泌褐色分泌物，菌落变红褐色，至全黑褐色（图2B，封二）。在40倍和100倍显微镜下观察发现，菌丝无色透明，薄壁，有隔膜，侧生或末端分支，未见锁状联合现象（图2C，封二）。

图3 供试菌株BYWZ的ITS序列扩增结果

图4 供试菌株BYWZ测序结果

图5 基于不同假芝属菌株rDNA-ITS序列构建的系统发育树

2.3 分子生物学鉴定

经引物ITS1和ITS4扩增，所得ITS序列产物片段大小在500 bp左右（图3），送样测序扩增结果的目的片段为637 bp（图4）。将测序后的结果在Genebank上进行比对，发现供试菌株与假芝属乌芝（Amauroderma rugosum，登陆号：KJ654361.1）的物种相似性最高，达99%。进一步利用MEGA6.06软件，以供试菌株与CBOL和GenBank中已知假芝属（Amauroderma）菌株ITS片段序列构建系统进化树，结果见图5，供试菌株与乌芝（Amauroderma rugosum）亲缘关系最近。结合形态学和ITS序列鉴定，可以确定本野生菌株为灵芝科假芝属乌芝，编号为白云乌芝（BYWZ）。

2.4 不同碳源对乌芝菌丝体生长的影响

由表1可知，以果糖为碳源时，乌芝菌丝长势好，长速最快，达5.25 mm/d，其次是葡萄糖、蔗糖；以乳糖为碳源时的菌丝生长速度最慢，仅有1.93 mm/d，显著低于其他处理，而以淀粉为碳源时则菌丝长势最弱，麦芽糖长势和长速居中。综上结果，果糖是该菌株菌丝生长的最适碳源，葡萄糖次之。

表1 不同碳源对BYWZ菌丝生长情况比较

2.5 不同氮源对乌芝菌丝体生长的影响

从表2可以看出，以麸皮、氯化铵等9种不同物质为氮源培养时，乌芝菌丝均能正常生长，其中以麸皮为氮源时生长速度最快，达4.48 mm/d，其次为豆粨粉、黄豆粉；以蛋白胨和酵母膏为氮源时，长速最慢，为2.03 mm/d，极显著低于其他处理。以无机氮源硫酸铵、硝酸铵、氯化铵为氮源时，长速居中，三者没有差异。以麸皮、豆粨粉、黄豆粉为氮源时菌丝长势最好，其次是酵母膏、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。综上结果，麸皮是该菌株菌丝生长的最适氮源，其次是豆粨粉。

表2 不同氮源对BYWZ菌丝生长情况比较

2.6 不同pH值对乌芝菌丝体生长的影响

由表3可知，乌芝菌丝可生长的pH范围较广，pH 4.0～9.0均可生长，但是随着pH值的升高，乌芝菌丝长速先升后降，pH 8.0时菌丝长速达到最快，为5.25 mm/d，其后长速减缓。pH值低于6时，菌丝长速显著降低。菌丝长势与菌丝长势一直，随着pH值的升高，长势趋好，pH 7.0～8.0时长势最好，表明乌芝菌丝适宜在中性偏弱碱性环境下生长。综上所述，该菌株喜适宜生长的pH范围为7.0～8.0。

表3 不同pH值对BYWZ菌丝生长情况比较

2.7 不同温度值对乌芝菌丝体生长的影响

不同温度试验结果（表4）表明，乌芝菌丝生长温度范围较广，15～35℃条件下均能生长。培养温度低于30℃时，菌丝长速随温度上升逐渐加快，且长势趋好，30℃时菌丝长速最快，长势最好，高于30℃时菌丝开始受到抑制，生长减慢，温度达35℃时，几乎不能生长，说明该菌株适宜生长温度范围为25～30℃。

表4 不同温度对乌芝菌丝生长速度与长势的影响

3 结论与讨论

本研究通过形态学与ITS序列鉴定，确定了一株野生假芝的分类学位置，该野生菌株属于灵芝科假芝属真菌，与乌芝（Amauroderma rugosum，登陆号KJ654361.1）同源性最高。生物学特性分析试验结果表明，该菌株菌丝生长最适碳源是果糖，其次是葡萄糖；最适氮源是麸皮，其次是豆粨粉；最适pH生长范围是pH 7.0～8.0；最适生长温度范围是25～30℃。

目前，世界范围内对假芝属驯化栽培的研究报道较少，仅少数真菌分类学者报道了其分类位置，采摘时间、地点等［15］。国内一些学者对邹盖假芝菌丝液体深层发酵条件［16-19］及引种袋料栽培、富硒菌株筛选等做了一些报道［20-21］，栽培种也仅有文献报道为台湾引种［22］，国内野生假芝资源仍然未被驯化利用。关于乌芝驯化栽培研究报道更是极少，其生物学特性、栽培特性、子实体营养成分分析等也不甚了解。本研究成功分离获得乌芝纯菌丝体，并首次对其生物学特性进行了研究，为乌芝的人工驯化栽培奠定基础，下一步我们将开展乌芝驯化栽培及其子实体成分研究，为乌芝的开发利用提供参考。

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（责任编辑 杨贤智）

中图分类号：S567.3+1

文献标识码：A

文章编号：1004-874X（2016）03-0072-05

收稿日期：2015-11-11

基金项目：广东省科技厅协同创新与平台环境建设项目（2014A070713009）；佛山市顺德区产学研合作项目（2014CXY16）；广东省农科院院长基金（201607）；广东省农科院蔬菜研究所所长基金（所-201504）

作者简介：肖自添（1981-），女，硕士，助理研究员，E-mail：xzt2006@163.com

通讯作者：何焕清（1964-），男，研究员，E-mail：hhq407@sian.com

Research on identification and biological characteristics of a wild Amauroderma rugosum

XIAO Zi-tian，LIU Ming，HE Huan-qing
（Vegetables Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Guangdong Vegetables Newly Technology，Guangzhou 510640，China）

Abstract：We collected a wild Amauroderma mushroom from the Baiyun mountain，Guangzhou City，Guangdong Province. By morphology and ITS sequence analysis，it was confirmed that the strain belonged to the genus Amauroderma family，and had highly homology with Amauroderma rugosum，strain numbered as BYWZ. Culture conditions results showed that the best carbon source for the mycelial growth was fructose，the best nitrogen source was wheat bran，temperature was optimal at 30℃，and the optimal pH range was 7.0-8.0. It will be conducive to further artificial domestic cultivation of A. rugosum，and the application of wild mushroom resources in our country.

Key words：wild Amauroderma；identification；ITS sequence；domestication