针刺对SAMP10鼠大脑皮层脂筏磷脂组成及胆固醇含量的影响

陈付艳,聂坤,于建春,韩景献(.天津中医药大学第一附属医院,天津 30093;2.天津中医药大学,天津 30093)

·动物实验·

针刺对SAMP10鼠大脑皮层脂筏磷脂组成及胆固醇含量的影响

陈付艳1,2,聂坤1,于建春1,韩景献1
(1.天津中医药大学第一附属医院,天津 300193;2.天津中医药大学,天津 300193)

目的观察针刺对快速老化痴呆鼠SAMP10脂筏磷脂组成及胆固醇含量的影响,并探讨针刺改善痴呆的机制。方法以快速老化痴呆鼠SAMP10和正常老化鼠SAMR1为模型,随机分为R1对照组、P10针刺组、P10非穴组、P10对照组,通过Mor ris水迷宫隐蔽平台试验检测小鼠的学习记忆能力,采用蔗糖密度梯度超速离心法分离脂筏,液质联用技术(LC/MS)测定脂筏中磷脂组成,比色法测定脂筏胆固醇含量。结果P10对照组与R1对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),逃避潜伏期明显延长;P10针刺组与P10对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),逃避潜伏期明显缩短;P10针刺组与R1对照组比较,第1～3天有显著性差异(P＜0.05),第4、5天与R1对照组比无显著性差异(P＞0.05);P10非穴组与P10对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。SAM鼠大脑皮层脂筏磷脂含有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)5类磷脂组分;SAMP10脂筏磷脂中PI、PS、PC相对百分比升高,PG、PE相对百分比降低,针刺后PG、PE相对百分比降低,PI、PS、PC相对百分比升高;P10对照组脂筏胆固醇含量比R1对照组少(P＜0.05);与P10对照组比较,P10针刺组有显著性差异(P＜0.05),脂筏胆固醇含量增加,并趋向于R1对照组;P10对照组与P10非穴组无显著性差异(P＞0.05)。结论调节脂筏胆固醇含量可能是“三焦”针法改善SAMP10鼠痴呆状况的机制之一。

针刺;快速老化小鼠P10;脂筏;胆固醇;磷脂类

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture on phospholipid com position and cholesterol content of lipid rafts in the cerebral cortex of SAMP10 m ice with rapid aging dementia and exp lore themechanism of acupuncture for alleviating dementia.M ethodSAMP10 m ice with rapid aging dementia and SAMR1 m ice with normal aging w ere used as themodel and random ized into R1 control,P10 acupuncture,P10 non-acupoint and P10 control groups.Mouse learning and memory abilitieswere tested by a hidden platform in the Morris water maze.Lipid rafts w ere separated by sucrose density gradient centrifugation.The phospholipid com position of lipid rafts w as determ ined by liquid chromatography/mass spectrometry(LC/MS).The cholesterol content of lipid rafts w asmeasured by colorimetry.Resu ltEscape latency lengthened marked ly in P10 control group compared with R1 control group and there w as a statistically significant difference(P＜0.05).Escape latency shortened markedly in P10 acupuncture group compared with P10 control group and there w as a statistically significant difference(P＜0.05).There w as a significant difference between P10 acupuncture and R1 controlgroups at day 1 to 3(P＜0.05)and no significant difference at day 4 to 5(P＞0.05).There w as no significant difference betw een P10 non-acupoint and P10 control groups(P＞0.05).Lipid rafts in the cerebral cortex of SAM m ice contain five kinds of phospholipid com position:phosphatidylcholine(PC),phosphatidy lethanolam ine (PE),phosphatidy lserine(PS),phosphatidylinositol(PI)and phosphatidylglycerol(PG).Of lipid rafts in SAMP10 m ice,the relative percentage of PI,PS and PC was high and the relative percentage of PG and PE w as low.The relative percentage of PG and PE decreased and the relative percentage of PI,PS and PC increased after acupuncture.The cholesterol content of lipid rafts decreased in P10 control group com pared with R1 control group and there w as a statistically significant difference betw een the two groups(P＜0.05).The cholesterol content of lipid rafts increased in P10 acupunctue group com pared with P10 control group and there was a statistically significant difference(P＜0.05).It tended to be the same as in R1 control group.There w as no statistically significant difference betw een P10 control and P10 non-acupoint groups(P＞0.05).ConclusionRegulating the cholesterol content of lipid rafts may be one of the mechanism s of“supplementing qi,regulating blood,consolidating the constitution and reinforcing the kidney”acupuncture for im proving dementia symptom s in SAMP10m ice.

[Keywords]Acupuncture;P10m icewith rapid aging;Lipid rafts;Cholesterol;Phospholipids

老年性痴呆(AD)发病率高,不仅给患者本人带来极大痛苦,也给社会和家庭带来沉重负担。因此,对AD的研究成了医学界的重要研究课题。近年来,有关脂筏的作用越来越引起学者的重视,研究其组分的变化与疾病的关系也越来越成为一个热门课题。研究显示[1],AD与脂筏功能紊乱有着密切的联系。脂筏(lipid raf ts)胆固醇具有维持脂筏结构和功能状态的重要作用[2],脂筏各种磷脂成分之间比例的变化及磷脂分子所含脂肪酸种类的变化与脑功能有关。本研究选用快速老化痴呆鼠SAMP10为研究对象,以正常老化鼠SAMR1作为对照,观察“三焦”针法(“益气调血,扶本培元”针法)对SAMP10鼠脂筏胆固醇含量及磷脂组成的影响,旨在探讨小鼠学习记忆能力的差异与脂筏胆固醇含量及磷脂组成的关系,为研究针刺改善AD的机制提供新的思路。

1　材料与方法

1.1动物选择及分组

选用20只7月龄正常老化鼠SAMR1和60只7月龄快速老化痴呆鼠SAMP10(津实动质M准字第006号),雌雄各半,体重(27±3)g。随机分为R1对照组、P10针刺组、P10非穴组、P10对照组,每组20只,雌雄各半。

1.2穴位选择和针刺方法

针刺组采用“三焦”针法,穴位定位参考《实验针灸学》(十五规划教材)[3]中的动物穴位图谱及文献[4],取膻中、中脘、气海及双侧血海、足三里。膻中、中脘、气海及双侧足三里均行捻转补法30 s,血海穴行捻转泻法30 s。非穴组行平补平泻捻转手法各30 s,取双侧胁下固定非经非穴点(双胁下髂嵴上10 mm)。R1和P10对照组进行与前两组相同时间和程度的捉抓刺激。各组做相应处理1个月,每天1次,第7天暂停1次。

1.3Morr is水迷宫

体育适性课堂教学应在教师的指导下，以学生为主，设置合适的、能突破重难点的、能激发学生学习兴趣的问题串，从而运用“一二·三六”教学模式探索实践技能来完成整个学习过程。

针刺结束后,各组小鼠进行5 d Mor r is水迷宫隐蔽平台试验[4],以评价针刺对SAMP10小鼠学习记忆能

力的影响。直径90 cm的水池平分成4个象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),试验时平台在水面以下2 cm左右,位于Ⅰ象限的正中央,位置保持不动。每天分别于8:00和14:00各训练1次,分别记录小鼠从池壁上Ⅱ、Ⅳ象限的中点入水至找到平台的时间(逃避潜伏期)及游泳路线长度。后将小鼠置于平台上休息10 s。如果90 s内找不到平台,潜伏期记为90 s。以两次潜伏期的算术均值作为这一天的成绩。

1.4脂筏磷脂和胆固醇的检测

1.4.1提取脂筏

水迷宫实验结束后各组动物同时行颈椎脱臼法处死,剥取大脑皮层,依照蔗糖密度梯度超速离心法提取脂筏,加入1 mL 1%Tri tonX-100裂解液缓冲液悬浮细胞,冰上玻璃匀浆器中匀浆,摇匀,放进4℃冰箱静置90 min,使充分裂解。再放进低温离心机离心15 min。抽取上层细胞裂解物,向下层细胞裂解物中加入1%Tr itonX-100裂解液缓冲液使其体积和第一次加完裂解液后相同,重复以上匀浆、静置、离心、抽提步骤。将两次抽提的上层细胞裂解物混合后放入离心管底部,加入相同体积的80%蔗糖溶液,用漩涡混匀器混匀,再沿离心管壁缓慢加入30%蔗糖液5mL,用5%的蔗糖溶液将离心管加满。4℃,超速离心20 h,320000×g。离心结束后,用注射器抽取离心管5%蔗糖和30%蔗糖交界面处一层不溶性絮状白色沉淀,加入Tr iz-NaClbuf fer液漂洗,离心机离心,转速10000×g,15 min。用注射器抽弃上层清洗液,留下下层沉淀即为脂筏。将相同组别的皮层所得脂筏合并在一只试管中。以上所有步骤均在0～4℃下进行[5]。

1.4.2液质联用技术(LC/MS)测定脂筏磷脂

从上述各组所提脂筏中各取出相同体积的脂筏依次置于标记好的空白试管中。提脂方法同文献[6]所述。过滤样品。

采用正相硅胶色谱柱(250 mm×4.6 mm)进行梯度洗脱分离,总计洗脱时间60 min。正相色谱流动相梯度,5 min 5%～15%流动相B(氯仿:甲醇:氢氧化铵:水=60:36.5:0.5:3),3 min 15%流动相B,25 min 15%～60%流动相B,10 min 60%流动相B,5 min 60%～5%流动相B,12 min 5%流动相B。质谱条件,采用电喷雾电离(ESI),喷雾电压4.8 kV,雾化气(N2)流量40个任意值单位(arb uni t),辅助气(N2)流量7个任意值单位(arb unit),离子传输毛细管温度300℃;全扫描范围为500～1400 m/z;进行负离子检测。

磷脂测定实验数据的计算,对单个离子峰面积与相应的内标物进行比较得到提取液中各磷脂分子的量,具体公式为,提取液中各磷脂分子的量(ppm)=[待测磷脂峰面积/内标物峰面积]×2.5,再计算各磷脂分子的量所占的相对百分比。

1.4.3比色法测定脂筏胆固醇

从上述所提脂筏中各取出20mL依次置于空白试管中。相同组别的做10支平行实验。提脂,晾干。配制胆固醇标准工作液梯度液,参照Folch法[7]和比色法绘制标准曲线,用紫外分光光度计测定各试管所提脂中胆固醇在550纳米处光吸收值,根据标准曲线计算样品中胆固醇浓度即可,方法同文献[6]所述。

1.5统计学方法

所有数据采用SPSS18.0软件进行统计学处理,计量资料用均数±标准差表示,水迷宫数据分别以4个不同的处理组和不同的训练天数作为组间和组内因素,采用双因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1针刺对学习记忆功能的影响

结果提示,P10对照组与R1对照组比较,两者有显著性差异(P＜0.05),逃避潜伏期明显延长,说明P10对照组学习获取能力较正常R1对照组明显降低,P10的学习获取能力有较明显的损害。P10针刺组与P10对照组比较,有显著性差异(P＜0.05),逃避潜伏期明显缩短;与R1对照组比较,第1～3天有显著性差异(P ＜0.05),说明P10针刺组逃避潜伏期较长,第4、5天与R1对照组比无显著性差异(P＞0.05),基本一致,说明针刺可改善SAMP10空间学习记忆的获取能力,使之趋向于正常小鼠,针刺后P10的学习成绩每天均有明显提高。P10非穴组与P10对照组比较,无显著性差异(P＞0.05),说明非穴刺激没有明显改善SAMP10小鼠空间学习记忆的获取能力。详见表1。

表1　各组隐蔽平台试验测试结果比较(±s,s)

表1　各组隐蔽平台试验测试结果比较(±s,s)

注:与R1对照组比较1)P＜0.05;与P10对照组比较2)P＜0.05

组别　n　1 d　2 d　3 d　4 d　5 d R1对照组　20　67.39±15.00　49.90±10.29　38.23±11.35　31.71±11.42　29.34±12.62 P10对照组　20　84.27±12.501)　69.12±17.851)　55.22±24.411)　64.37±11.131)　64.79±14.621)P10针刺组　20　77.23±16.291)2)　55.46±10.261)2)　54.53±17.991)2)　32.10±9.422)　28.47±13.482)P10非穴组　20　79.30±9.15　76.85±10.68　65.36±17.12　54.21±5.89　52.41±9.37

2.2针刺对脂筏磷脂组成的影响

在同一分析条件下,与磷脂标准品对照,可鉴定出SAM鼠大脑皮层脂筏磷脂含有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)5个磷脂组分。各磷脂组分的相对百分比见表2。可以看出,SAMP10鼠大脑皮层脂筏磷脂以PE、PC为主,共占总磷脂的87.27%,其中PC在总磷脂中的比例最高。与SAMR1相比,SAMP10脂筏磷脂中PI、PS、PC相对百分比升高,PG、PE相对百分比降低。针刺后PG、PE相对百分比降低,PI、PS、PC相对百分比升高。详见表2。

表2各组磷脂组分相对百分比　(%)

SAMP10脂筏磷脂中含不饱和脂肪酸链的磷脂所占相对百分比与SAMR1相比无明显区别,P10针刺组及P10非穴组增高,P10针刺组比P10非穴组变化更明显。PG中含不饱和脂肪酸链的磷脂相对百分比增高,P10针刺组及P10非穴组增高,P10非穴组比P10针刺组变化更明显;PE中含不饱和脂肪酸链的磷脂相对百分比降低,P10针刺组及P10非穴组升高,P10针刺组比P10非穴组变化更明显;PI中含不饱和脂肪酸链的磷脂相对百分比增加,P10针刺组及P10非穴组使之降低,P10针刺组更趋向于R1;PC中含不饱和脂肪酸链的磷脂相对百分比增加,P10针刺组及P10非穴组增高,P10针刺组比P10非穴组变化更明显。PS中含不饱和脂肪酸链的磷脂相对百分比4组之间差别不明显。详见表3。

表3　含不饱和脂肪酸链的磷脂在各磷脂组分中的相对百分比　(%)

2.3针刺对脂筏胆固醇含量的影响

P10对照组与R1对照组比较有显著性差异(P＜0.05),脂筏胆固醇含量比R1胆固醇含量少。针刺后P10针刺组与P10对照组比较有显著性差异(P＜0.05),脂筏胆固醇含量增加,并趋向于R1对照组;P10非穴组与P10对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。详见表4。

表4各组胆固醇浓度比较　(±s,g/L)

表4各组胆固醇浓度比较　(±s,g/L)

注:与R1对照组比较1)P＜0.05;与P10对照组比较2)P＜0.05

组别　n　　胆固醇浓度R1对照组　10　7.974±1.20 P10对照组　10　6.492±0.791)P10针刺组　10　7.73±2.292)P10非穴组　10　6.391±0.85

3　讨论

中医学理论认为,三焦是体液运行之径,有宣通气血津液、腐熟水谷、通调水道的作用。老年脂代谢异常属中医学“痰浊”范畴。痰浊为水谷津液运化失常所致,是脏腑功能失调,气血失和的表现。因此,要防治痰浊就必须调理水液代谢功能,要维持脂质代谢的平衡就需要三焦气化功能正常。韩景献教授提出“三焦气化失司”导致老年性痴呆论,从而确立了“三焦”针法[8],诸穴合用可调补上中下三焦之气,活血化瘀,共奏“气行则血行、血行则水行”之功,以蠲化痰浊,并调整五脏六腑之虚实。该针法能增加海马脂筏募集的激酶类信号蛋白数量[9],同步增加神经元细胞小G蛋白分子和骨架相关蛋白[10];在临床治疗老年性痴呆中也取得了较好的疗效[11],并能提高老年人认知相关脑区葡萄糖代谢[12]。

脂筏是一种富含胆固醇、鞘(磷)脂和蛋白质的微结构域,不溶于非离子去污剂,是细胞膜的功能结构域[13-14]。SAMP10脂筏不仅存在磷脂组分异常,而且存在胆固醇代谢障碍,表现为脂筏各磷脂成分之间比例及磷脂中含不饱和脂肪酸链的磷脂的比例发生了变化,脂筏胆固醇含量下降。脂筏胆固醇和磷脂都参与髓鞘的形成,髓鞘对于运动功能和行为能力有重要作用。本实验显示SAMP10脂筏磷脂组分及胆固醇含量均存在异常,提示因此而导致的神经递质代谢障碍及信号传导障碍可能是SAMP10脑组织老化及伴随的智力低下的原因之一。胆固醇强化膜的刚性,而磷脂决定着膜的柔软性[15]。由此我们推测,SAMP10脂筏较低的胆固醇浓度及PC、含不饱和脂肪酸链磷脂含量的增加可能导致脂筏流动性的改变,使其募集蛋白及信号转导的功能都减弱,并影响其囊泡胞吐与胞吞、突触传递及凋亡等生理与病理过程,从而影响SAMP10认知功能。

针刺后SAMP10脂筏各种磷脂组分比例及含不饱和脂肪酸链的磷脂在各磷脂组分中所占的相对百分比都有不同程度的改变,脂筏胆固醇含量升高,趋向于正常对照组。结合针刺后水迷宫结果显示SAMP10认知和记忆能力趋于正常小鼠,提示针刺可通过良性调节脂筏胆固醇的含量,维持SAMP10大脑皮层神经元的脂筏结构和功能,从而改善SAMP10认知障碍。脂筏在膜上并不是静止不动的,当有刺激时它会运动、聚集,故针刺腧穴和非穴位刺激都能对其组分起到调节作用。针刺能良性调节脂筏胆固醇的含量,非穴刺激反而使脂筏胆固醇的含量降低,说明针刺和非穴对脂筏的调节作用明显不同,这有可能是非穴组对认知的改善作用不明显,而针刺组对认知有明显改善作用的原因之所在。

SAMP10脂筏磷脂中PI、PS、PC相对百分比升高,PG、PE相对百分比降低,针刺后PG、PE、PI、PS、PC相对百分比都不趋向于正常对照组,考虑两种可能,针刺并不能良性调节脂筏磷脂中各组分的相对含量;或由于样本量太少对结果造成影响。今后应加大样本量进行进一步研究。

近年来国内对脂质代谢与AD关系的研究多集中在组织水平的血脂代谢上,从细胞水平探讨脂类代谢与AD关系的并不多见,研究有很大的局限性。本研究从脂筏胆固醇含量及磷脂组成与AD的发病这一环节研究得出,调节脂筏胆固醇含量可能是“三焦”针法改善SAMP10鼠痴呆状况的机制之一。我们的研究也存在一些不足之处,在我们的实验中,鞘磷脂作为脂筏的重要组成成分没有检测;脂组学分析技术成本比较高,样本例数过少;脂质种类繁多,相互作用复杂,脂组学的分析可以涉及到很多方面,由于时间的关系,我们没有从所有角度进行统计,因此只能对实验结果做初步探讨。所有这些,都为我们的下一步研究明确了方向。

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Effect of Acupuncture on Phospholipid Com position and Cholesterol Content of Lipid Rafts in the Cerebral Cortex of

CHEN Fu-yan1,2,NIE Kun1,YU Jian-chun1,HAN Jing-xian1.1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine FirstHospital,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University ofTraditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.02.0210

1005-0957(2016)02-0210-04SAMP10 M ice

国家自然科学基金项目(30873302,81072882)

陈付艳(1981-),女,主治医师,博士

2015-05-20