榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒子制备①

李英夫,宣兆博,王　鹤,廉晓宇

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)



榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒子制备①

李英夫,宣兆博,王鹤,廉晓宇

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

摘要:目的：分析β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒子制备工艺的优化。方法：把聚氰基丙烯酸正丁酯作为载药材料，以包封率为考察标准，借助界面缩聚法，并通过正交试验和单因素实验设计对制备工艺进行优化。结果：优化后的制备工艺所获得的榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒大小均匀、形态规则、无黏连，平均包封率为90.17%，平均粒径为260nm。结论：该优化方法切实可行，能有效提升榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备质量。

关键词:榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯；包封率；正交试验；纳米粒

β-榄香烯是重要的抗癌单体，以抗癌中药榄香烯挥发油作为生产原料，通过精馏纯化等一系列工艺并去除δ、γ-榄香烯等成分获得。应用于癌症治疗中，具有很高的选择性，且能增强免疫作用、无肝肾毒、骨髓抑制等优势，唯一的缺陷就是不良反应较高[1,2]。为降低其不良反应，并进一步提高其肝癌治疗的疗效，本实验对药物制备进行了优化，效果良好，现总结如下。

1仪器与试药

1.1仪器

日本电子公式产JEOL JEM—1200EX 透射电镜；高效液相色谱仪(Agilent 1100)；美国 PSS 粒度分析仪公司产；Nicomp 380ZLS激光粒度仪；台式高速冷冻离心机(TGL—20M)；集热式恒温加热磁力搅拌器(85—1 型)。

1.2试药

β-榄香烯原料药(质量分数>98%)从大连远大制药有限公司购得；β-榄香烯对照品(质量分数>99%)，从南京森贝伽生物科技有限公司购得，批号为100268-200401；α-氰基丙烯酸正丁酯由浙江金鹏化工股份有限公司提供；泊洛沙姆 188EP标准品由法国盖德化工产；右旋糖酐-70为北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产；试剂纯度要求：乙腈(色谱纯)，其余均为分析纯。

2方法

2.1单因素试验

单因素实验均在固定投药量15 mg、BCA75μL、油水比 1︰2、pH 3.0、Poloxamer 188(40mg)与 Dextran-70(40mg)条件下进行[3]。(1)考察制备温度，采用不同的制备温度20℃、30℃、40℃，观察其包封率结果无显著变化，于是选择室温作为制备温度；(2)考察制备时间，为提高包封率，在有机相与水相混合后常需要一段时间的搅拌，因此需考虑搅拌时间的影响。分别采用3、4、5h的搅拌时间观察β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯的包封率，结果显示不同搅拌时间包封率无显著差异(P>0.05)。可见搅拌时间对其包封率无显著影响，且3h所得包封率较高，搅拌时间设置为3h；(3)pH会对包封率和界面聚合速度同时产生影响，以室温为制备温度，3h搅拌时间，并分别以2.0、3.0、4.0进行试验，结果显示pH3.0时，聚合速度和包封率最为理想，故水相pH值设置为3.0；(4)考察表面活性剂用量，制备温度为常温、3h搅拌时间、水相pH为3.0，考察Dextran-70和 Poloxamer188分别为30、40、50mg的包封率，结果显示50mg时最大为90.1%，故设置选择两种表面活性剂各50mg[4]。

2.2制备过程的优化方法

(1)结合上述单因素实验的结果，我们知道最佳的制备温度、搅拌时间、水相pH值和表面活性剂用量，现对投药量、油水比、转速和BCA用量的最佳组合方式进行分析，依次设置A、B、C、D四个正交因子进行正交实验，正交试验设计表选择为L9(34)[5]，对应的因素水平见表1。

表1 因素水平

表2　正交实验设计和结果(n=3)

(2)常温条件下，以BCA和β-榄香烯的丙酮溶液作为有机相，以Dextran-70和Poloxamer188各50mg用水溶解获得水相，并用0.01mol/L标准盐酸溶液将水相pH精准调节到3.0。通过一定转速磁力搅拌作用，缓慢把有机相和水相按比例混合，3h的搅拌时间，随后用NaOH溶液(0.01mol/L)调节pH值到7.0，搅拌0.5h用分液漏斗(G3)静置，即可得β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯的胶体溶液。以表-1因素水平，并按表2中正交实验表完成实验，见表2。

2.3确定包封率测定方法

(1)色谱条件，室温条件下，乙腈-水为(90:10)，体积流量设置为(1.0mL/min)，以 Diamonsil TM C18(5μm，150mm×4.6mm)为色谱柱，设置210nm的检测波长[6]。(2)线性关系考察，分别量取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL的β-ELE 对照品储备液(0.896 mg/mL)，用甲醇稀释后摇匀，分别精密吸取10μL的对照品储备液，分别在液相色谱仪下观测其峰值面积，并以峰值面积为y轴坐标，对照品的浓度为x轴坐标，做线性回归分析，并对回归方程进行计算。结果显示，β-榄香烯线性关系最好的浓度范围是(22.4～179.2)μg/mL。(3)空白对照试验，按照上述优化后的制备方法进行操作，但制备过程中并不选择加入β-榄香烯，从而制得空白纳米粒，空白对照液的制备方法和供试品完全相同。分别精密吸取三种溶液10μL研究，分别为空白对照液、纳米粒沉淀供试品溶液、纳米粒对照品溶液，在相同的色谱条件下完成测量，测量结果显示，在同等保留时间下的空白对照液并没有出现峰值，因此排除其测定干扰[7]。(4)精密度实验，选择低、中、高3中对照品溶液，在1d重复5次进样操作，计算1d内的精密度变化，结果显示其RSD分别为0.64%、0.79%、0.91%，随后测量其日间精密度，每天进样一次，连续5d，测得RSD分别为0.82%、0.93%、1.82%。日间和日内精密度均较好。(5)稳定性实验，选择同一样品均分为5份，每间隔2h进样一次，分别测定其色谱峰面积，8h后所得RSD为1.27%，证明其在8h内稳定。(6)回收率实验，选择已经测定好的β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯胶体溶液，精密测取6份5mL溶液，转入10mL容量瓶中，均精密加入适量的β-榄香烯对照品溶液1.0mL，严格按照相同的制备步骤以及色谱条件下获得制品并进样，最后观测并计算其回收率的均值。测得，β-榄香烯的回收率均值为96.7%，RSD则为1.7%，稳定性良好。(7)包封率测定方法，综合分析选择低温超速离心的方法，精密测取1mLβ-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯胶体溶液，转入离心管中，转速设置为18000r/min，低温4℃，离心时间1.5h，去掉上清液，用适量的流动相将纳米粒沉淀溶解，转入10mL容量瓶，加流动相滴准，摇匀过滤，扔按上述色谱条件，获取β-榄香烯实际药物量(W1)。另精密测取1mLβ-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯胶体溶液，转入容量瓶(10mL)，加流动相滴准，摇匀滤过，与上述测定方法相同，测定药物的总量(W0)，包封率计算方法为(W1/W0)，并对其进行方差分析，见表3。

表3　方差分析

3结果

3.1工艺验证结果

为验证优化后工艺质量，按照上述正交实验所得的最佳工艺组合方式进行实验，在同样条件下分别制备3批β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯成品，测量其包封率，结果显示3批成品包封率分别为90.2%、89.8%、90.3%，均值为90.1%，证明其工艺非常成熟。

3.2形态观察和粒径测定结果

按照上述所求最佳工艺制备条件制得β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯胶体溶液，将溶液稀释并用磷钨酸(1.5%)染色后采用透射电镜对其形态进行观测，电镜结果显示，制品中纳米粒大小均匀，有规整的形态，且无黏连。采用激光粒度分析仪测量其粒径均值，结果粒径均值为260nm。

4讨论

在制药工艺中，纳米粒形态的药物制备方法主要有界面缩聚法和乳化聚合法，由于β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯的原料药为β-榄香烯，其为一种挥发性强的脂溶性油类，因此不宜选择乳化聚合法。常规的方法是将BCA和β-榄香烯溶解在有机溶剂中，并作为油相与水相缓慢混合，音α-BCA中含有βC+，因此可与水中的OH-离子发生聚合反应，从而包裹β-榄香烯获得纳米粒。为包封率的影响因素主要为聚合反应速度、pH值、油水比例等。本文结合单因素实验和正交试验设计对其制备工艺进行了优化，并进行了实验室验证，结果显示优化后的制备方法实际可行，制得纳米粒均匀、平整，且粒径满足要求。

参考文献：

[1]王博,袁子民,程岚. β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备工艺研究[J]. 中草药,2011,3:474-477

[2]陈旭,曾建红,林家逊,等. GC-MS测定莪术油聚氰基丙烯酸正丁酯毫微粒中4个成分的含量[J]. 药物分析杂志,2011,9:1790-1793

[3]袁子民,王静,王博,等. β-榄香烯聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒冻干粉针的制备及理化性质研究[J]. 时珍国医国药,2013,3:650-651

[4]高士雅,徐敏,陈志鹏,等. 聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒在药物传输系统中的应用[J]. 中国新药杂志,2013,11:1278-1284

[5]陈美,余江南,徐希明,等. 载蟾毒灵聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备及其评价[J]. 中草药,2015,9:1296-1301

[6]陈贵起,段凤英. 我国纳米粒药物制剂的研究现状[J]. 天津药学,2009,2:50-52

[7]徐巍,邓树海,李艳辉. 大蒜素聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒的制备工艺研究[J]. 中国新药杂志,2006,6:448-451

基金项目：①黑龙江省自然科学基金项目，编号：H201369。

作者简介：李英夫(1979～)男，黑龙江明水人，硕士，主治医师。

中图分类号：R284

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)03-0100-02

(收稿日期：2016-03-07)