壳聚糖修饰脂质体对姜黄素的包载作用

严佳蕾 王小永

摘 要：通过改变壳聚糖的浓度探讨不同浓度壳聚糖修饰的脂质体对姜黄素的包载作用。采用薄膜蒸发法制备姜黄素脂质体，并以不同浓度的壳聚糖对姜黄素脂质体进行修饰。通过测定修饰后的姜黄素脂质体的物理化学性质，探讨不同浓度的壳聚糖对姜黄素脂质体的包封率以及姜黄素的稳定性、抗氧化性以及荧光、紫外光谱性质的影响。当壳聚糖质量分数由0增大到0.4%时，脂质体内姜黄素的稳定性以及DPPH自由基清除能力也不断增大。当壳聚糖质量分数进一步增加到0.5%～0.7%时，姜黄素的稳定性与抗氧化能力逐渐减小。由此表明存在最佳的壳聚糖质量分数（0.4%），在此条件下壳聚糖修饰脂质体对姜黄素的保护作用最佳，姜黄素的稳定性、抗氧化能力最高。

关键词：姜黄素；脂质体；壳聚糖；稳定性；抗氧化

文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2016）09-0061-06

0 引 言

姜黄素是从姜黄的根茎中提取的一种多酚类化合物，其抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化等多种药理学性质逐渐受到国内外学者的重视[1]。尽管姜黄素在治疗和预防人类疾病方面安全且高效，但姜黄素的水溶性较差、生物利用率低等缺点很大程度上限制了姜黄素在临床医学上的应用。针对姜黄素的性质以及存在的问题，最常见的方法是通过剂型改造提高姜黄素稳定性、水溶性进而提高姜黄素的生物利用率。脂质体是将药物包封于类脂双分子层形成的超微型球状制剂，是一类水溶性良好的药物载体。脂质体的膜材与细胞膜的组成成分极为类似，与机体的生物相容性非常好。作为药物载体，脂质体具有载药靶向运行、延长疗效、降低不良反应等优点[2]，已经有多种脂质体用于临床研究，具有广阔的应用前景[3]。将壳聚糖与脂質体以及牛血清蛋白结合起来能够制备出更稳定的载药体系，用于包载姜黄素不仅能够提高姜黄素的稳定性与生物利用度，同时可以降低姜黄素的用量，减少对其他部位的毒副作用，以便为其临床应用提供更好的基础。本文主要是在pH 6.5的条件下，研究不同质量分数壳聚糖（0.1%～0.7%）修饰的脂质体对姜黄素的包载作用。通过测定姜黄素脂质体的物理化学性质，探讨壳聚糖对姜黄素的包封率、稳定性、抗氧化性、以及荧光、紫外光谱性质的影响。

1 实验试剂与仪器

1.1 实验试剂

姜黄素（m/m：70%，Sigma）；卵磷脂（来源于大豆，纯度55%，Sigma）；壳聚糖（AR，Sigma）；胆固醇（m/m：99%，Sigma）；三氯甲烷（AR，上海化学试剂有限公司）；无水乙醇（AR，上海凌峰化学试剂有限公司）；无水甲醇（AR，国药集团化学试剂有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，AR，Sigma）。

1.2 实验仪器

分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；旋转蒸发仪（上海申胜生物技术有限公司）；紫外可见分光光度计UV2450（日本岛津公司）；荧光光谱仪FLS900（英国爱丁堡公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（上海科兴仪器有限公司）；低温恒温槽（上海比朗仪器有限公司）；Nano ZS动态光散射仪（DLS）（英国马尔文公司）；PHS-3C型数字pH计（上海伟业仪器厂）。

2 实验方法

2.1 配置pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液

分别称取一定量Na2HPO4和NaH2PO4固体颗粒，加入重蒸水制得0.01mol/L的Na2HPO4溶液和0.01 mol/L的NaH2PO4溶液。将两种磷酸盐溶液以一定比例混合，并同时测定混合溶液的pH值，直到溶液的pH值为6.5。

2.2 配置不同质量分数壳聚糖溶液

分别称取一定量低分子量壳聚糖溶解在1%盐酸溶液中。由于壳聚糖溶液需要以1∶1的体积比与脂质体溶液混合进行修饰，因此配置的壳聚糖溶液质量分数分别为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%（混合后的质量分数为0.1%～0.7%）。

2.3 姜黄素脂质体的制备

采用薄膜蒸发法制备姜黄素脂质体。首先利用电子天平按照质量比3∶1精确称取一定量卵磷脂和胆固醇。将卵磷脂和胆固醇的混合物加入到体积比为2∶1的氯仿甲醇混合有机溶剂中，用玻璃棒搅拌使其充容溶解后转移至茄型瓶。同时称取一定姜黄素固体粉末，转移至茄型烧瓶中使得姜黄素的物质量浓度为50 μmol/L。在43 ℃的水浴条件下利用旋转蒸发仪将混合溶液旋蒸30 min，使其旋转蒸发成膜直至混合溶剂完全蒸发。加入30 mL pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液并在磁力搅拌器上搅拌30 min使得瓶壁上的脂质体膜充分溶解在缓冲溶液中。最后60 ℃水浴条件下孵化60 min，最终得到所需姜黄素脂质体。

2.4 壳聚糖修饰的姜黄素脂质体的制备

将质量分数为0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%的壳聚糖溶液与姜黄素为50 μmol/L的姜黄素脂质体溶液等体积混合，得到实验所需的7个样品溶液，即质量分数为0.1%～0.7%壳聚糖修饰的姜黄素脂质体，溶液中姜黄素和磷脂的物质量浓度分别为25 μmol/L和280 μmol/L。

2.5 姜黄素包封率的测定

采取离心法测定姜黄素脂质体的包封率。量取姜黄素脂质体、0.1%～0.7%壳聚糖修饰的姜黄素脂质体溶液各3 mL置于离心管中， 14 000 r/min离心30 min，下层沉淀部分即制备的姜黄素脂质体。倒去含有游离姜黄素的上层溶液，用无水乙醇溶液溶解离心管底部的姜黄素脂质体。利用姜黄素在乙醇溶液中的标准曲线得到姜黄素脂质体中姜黄素的质量浓度。包封率的具体计算如下所示：

包封率=■×100%（1）

2.6 粒径及Zeta电位的测定

使用Nano ZS动态光散射仪来测定姜黄素脂质体以及壳聚糖修饰后姜黄素脂质体的粒径和Zeta电位。在测量之前，需将制备的待测样品用pH 6.5的PBS溶液稀释10倍。将仪器温度设置到25 ℃后预热30 min，溶液加入样品池后放入仪器使样品在25 ℃下恒温5 min便可开始测量，每个样品测量3次以降低误差。

2.7 不同样品中姜黄素稳定性的测定

取制备得到的姜黄素脂质体以及0.1%～0.7%壳聚糖修饰的姜黄素脂质体于烧瓶中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液搅拌使其充分混合。利用紫外可见光谱仪测定不同样品中的姜黄素在25 ℃、pH 7.4的正常光照条件下经过10，20，30，40，50，80，110，140，

200 min后在特征吸收峰425 nm处的吸光度变化，以反映姜黄素在溶液中降解的程度。

作为对照，同时测定了游离姜黄素在相同条件下静置10，20，30，40，50，80，110，140，200 min后的降解情况，通过比较姜黄素的降解程度来说明脂质体和壳聚糖修饰的脂质体对姜黄素的保护作用。

2.8 姜黄素的紫外、荧光发射光谱的测定

使用紫外可见光谱仪和荧光发射光谱仪在25 ℃、pH 6.5的条件下测量游离姜黄素、姜黄素脂质体、0.1%～0.7%壳聚糖修饰的姜黄素脂质体在300～600 nm波长范围内的紫外吸收光谱以及450～650 nm之间的荧光发射光谱。

2.9 姜黄素的DPPH清除率的测定

采用DPPH自由基清除的方法来测定不同样品中姜黄素抗氧化能力。在25 ℃的条件下，取游离姜黄素、姜黄素脂质体及壳聚糖修饰后的姜黄素脂质体分别与0.015 mol/L的DPPH溶液在棕色瓶内均匀混合，静置20 min后开始测量DPPH在517 nm处紫外强度的变化。通过下式来计算不同样品中姜黄素的DPPH自由基清除率：

DPPH Scavenging Capacity=（1-■）×100%

（2）

式中：Ablank——姜黄素样品和乙醇的混合溶液在517 nm处的紫外吸光度；

Asample——DPPH和姜黄素样品混合溶液反应20 min后在517 nm处的紫外吸光度；

Acontrol——DPPH和重蒸水混合溶液在517 nm处的紫外吸光度。

3 结果与讨论

3.1 姜黄素标准曲线的测定

配置质量浓度分别为0.75，1.50，2.25，3.00，3.75，

4.50，5.25 mg/L的姜黄素乙醇溶液，测定其在425 nm处吸光度的数值从而得到表示姜黄素吸光度（A）与质量浓度（Ccurcumin）关系的标准曲线，如图1所示。通过拟合实验数据得到直线方程：

A=0.134 2Ccurcumin+0.061 4（r=0.998 7）（3）

3.2 姜黄素包封率的测定

姜黄素脂质体、0.1%～0.7%壳聚糖修饰的姜黄素脂质体的包封率数据见表1。

在实验温度为25 ℃、pH 6.5的条件下，姜黄素脂质体样品中姜黄素的包封率为80.1%，远高于Takahashi等[4]研究得出的姜黄素包封率。导致包封率与文献报道值不同的原因可能是制备脂质体膜材料来源以及姜黄素脂质体所处环境的pH值不同。在不同pH条件下姜黄素脂质体内姜黄素的降解机理和动力学过程都已被充分研究，Wang等[5]研究表明在pH 7.2的条件下，90%的姜黄素会在30 min降解完毕；而当pH为6.5时，超过97%的姜黄素都能够在溶液中稳定存在。因此本次实验条件的pH 6.5是促使姜黄素包封率高于文献值最重要的原因之一。用0.1%～0.7%壳聚糖修饰过的姜黄素脂质体的姜黄素包封率分别为：82.4%，83.4%，84.5%，85.3，85.0%，83.7%，82.0%，由此推断壳聚糖在姜黄素脂质体的外层形成了一圈“保护层”，使得在制备、反应以及实验过程中姜黄素脂质体的结构得到了更好的保护，避免了姜黄素从脂质体内转移到溶剂当中。当壳聚糖为0.4%时姜黄素的包封率最高，随着质量分数继续增大，姜黄素的包封率逐渐递减。由此可以推断利用壳聚糖修饰姜黄素脂质体时，当壳聚糖的浓度超过一定范围时，会促使脂质体结构稳定性降低，从而使得姜黄素从脂质体内泄露。

3.3 姜黄素脂质体的粒径及Zeta电位的测定

姜黄素脂质体、0.1%～0.7%壳聚糖修饰的姜黄素脂质体的粒径见表2。

当壳聚糖的质量分数在0.1%～0.4%的时，粒径随着其增大而逐渐减小。由此现象推测得到当用浓度较小的壳聚糖溶液修饰姜黄素脂质体时，壳聚糖通过静电作用在脂质体外层形成“保护层”较为松散。随着壳聚糖浓度的不断增大，壳聚糖在脂质体外的排列逐渐紧密，因此当质量分数为0.4%时体系的平均粒径最小。继续增加到0.7%时，脂质体粒径反而逐渐增大，由此推测得到当溶液中壳聚糖浓度过大，过多的没有吸附到脂质体上的壳聚糖会引起体系的混乱度增大、脂质体之间发生聚集从而导致脂质体的平均粒径逐渐变大。

姜黄素脂质体、0.1%～0.7%壳聚糖修饰的姜黄素脂质体的Zeta电位如表3所示。当Zeta电位的数值在±30～±60 mV這个范围内就可以推测该体系具有良好的稳定性。本次实验中姜黄素脂质体的Zeta电位是-32.6 mV，较大的排斥力使得姜黄素脂质体体系具有较好的稳定性。带正电的壳聚糖是通过静电作用与带负电的脂质体相结合[6]，当加入壳聚糖对姜黄素脂质体进行修饰后发现体系的Zeta电位由-32.6 mV变成了45.1 mV，这说明壳聚糖已经通过静电作用吸附到姜黄素脂质体的表面。当壳聚糖由0.1%增加到0.2%时发现体系的Zeta电位增大了4 mV，结合粒径结论推测当壳聚糖浓度还较低时，随其增大会有更多的壳聚糖通过静电力与脂质体表面发生结合，从而导致体系的Zeta电位的增大。当壳聚糖质量分数为0.2%～0.7%时，体系的Zeta电位趋于恒定值，表明带正电的壳聚糖与带负电的脂质体之间的吸附作用达到饱和。

3.4 姜黄素的稳定性

表4和图2是游离姜黄素、姜黄素脂质体以及0.1%～0.7%壳聚糖修饰的姜黄素脂质体中姜黄素在200 min内的降解率以及姜黄素的降解曲线。由实验结果可见在200 min后游离的姜黄素降解了40.6%，当采用脂质体对姜黄素进行包载后，姜黄素的降解率减少至22.1%，表明脂质体对姜黄素起到了很好的保护作用，在很大程度上提高了姜黄素的稳定性。有学者探讨了游离姜黄素以及姜黄素脂质体中姜黄素的降解情况，研究结果表明姜黄素的降解是一级动力学反应[5]。通过计算得出游离姜黄素的的一级降解速率常数是0.002 5 min-1，姜黄素脂质体中姜黄素的一级降解速率常数是0.001 2 min-1。前者是后者降解速率的2.1倍，由此表明脂质体可以很大程度上保护姜黄素，减缓姜黄素在人体中的降解。人体内的pH值为7.4，在此条件下姜黄素极易发生降解，是因为姜黄素分子中的二酮脂肪链的活性碳原子上的质子丢失，导致共轭双烯结构的破坏[7]。当用脂质体包载姜黄素后，姜黄素分子的苯氧基介于脂质体与溶液的交界面；与此同时烯醇基团和另外一个苯氧基团在脂质体的疏水核内部，烯醇式镶嵌到磷脂双分子层内从而提高了姜黄素的稳定性[8]。由于脂质体膜有一定的通透性，因此包封的药物在经过一定时间的放置后容易泄露到膜外[9]。当进一步用不同浓度的壳聚糖修饰姜黄素脂质体后姜黄素的降解率有了进一步的减小，说明水溶性的壳聚糖通过静电作用在脂质体表面形成了一层致密的亲水保护层，降低了脂质体膜的流动性，避免了包载的姜黄素从脂质体内向外渗漏。但随着壳聚糖质量分数的增加，溶液的粘度也会逐渐增加。由于大分子间摩擦力、缠绕情况的增加使得壳聚糖溶液流动困难[10]。因此当壳聚糖的质量分数超过0.4%时，整个体系的浓度变大，导致脂质体之间容易发生絮凝、沉降。同时由于壳聚糖大分子之间摩擦力的增强会导致脂质体结构的稳定性降低，脂质体发生破裂从而使得包载在内的姜黄素渗漏到溶液中。

3.5 姜黄素的紫外可见吸收光谱、荧光发射光谱的测定

游离姜黄素、姜黄素脂质体、0.1%～0.7%壳聚糖修饰的姜黄素脂质体的粒径以及姜黄素脂质体的紫外光谱图、荧光光谱图见图3、图4。由图3可知游离姜黄素在427 nm处有最大吸收峰，在360 nm处存在一个肩峰[11]。而姜黄素脂质体中的姜黄素在424 nm处有最大吸收峰，在445 nm处有一个吸收肩峰。游离姜黄素在360 nm处存在肩峰是因为在水溶液中存在少量去质子化的姜黄素离子。当姜黄素被包载到脂质体中后，360 nm处的肩峰消失，这个现象说明磷脂双分子层与姜黄素之间的相互作用避免了姜黄素在溶液中去质子化形成姜黄素离子。当姜黄素所处环境的极性减小时，π-π*跃迁的吸收峰蓝移，n-π*跃迁的吸收峰发生红移，姜黄素的紫外吸光度增强[12]。因此，当样品中姜黄素的浓度一定时，包载在脂质体内的姜黄素的紫外吸收强度比游离姜黄素的紫外吸收强度要大。同时还研究了不同体系中的姜黄素在25 ℃，pH 6.5条件下的荧光发射光谱，由图4可知游离姜黄素的荧光强度十分低，其原因是游离姜黄素处于一个溶液极性较大的环境，在575 nm处的荧光发射强度十分低。当姜黄素处于脂质体磷脂双分子层中时，由于所处环境的极性减小，因此姜黄素的荧光发射强度明显增大，并且最大发射峰的位置发生了蓝移，这与紫外的实验结论相吻合。

由图3、图4可知，当用不同浓度的壳聚糖对姜黄素脂质体进行修饰后，样品体系中姜黄素的紫外吸收强度以及荧光发射强度都有了相应的增强。由于在制备过程中保证所有样品中姜黄素的原始浓度恒定，因此促使姜黄素紫外吸收值和荧光发射强度增大的原因可能是在0.1%～0.4%的质量分数范围内，壳聚糖的修饰使更多的姜黄素与磷脂双分子层结合，脂质体的结构更加稳定从而使得姜黄素得到了更好的保护。但是，当壳聚糖超过0.5%后，正如前述体系的稳定性因壳聚糖粘度增大、流动性差而降低，使得脂质体发生破裂，而姜黄素从极性低的磷脂双分子层中渗透到极性较大的缓冲溶液中[13]。

3.6 姜黄素DPPH清除率的测定

由图5可以看到在pH 6.5的缓冲溶液中，游离姜黄素的DPPH自由基清除率仅有21.6%。曾有文献报道在有机溶剂中游离姜黄素对DPPH自由基的清除率超过50%[14]，造成如此大差异可能是由于姜黄素所在环境的极性不同。姜黄素脂质体对DPPH的清除率大于40%，这表明有更多的DPPH自由基获得了脂质体内姜黄素所贡献的氢原子[15]。当姜黄素位于疏水的磷脂双分子层间时，会有更多的疏水性的DPPH分子与姜黄素发生反应，获得姜黄素给出的氢质子。文中，DPPH自由基清除率的高低首先取决于不同样品中姜黄素的包封率。而且当壳聚糖质量分数为0.1%～0.4%时，壳聚糖的修饰为姜黄素与DPPH自由基之间的反应创造了更加理想的微环境条件。当壳聚糖质量分数超过0.5%后，由于脂质体结构的稳定性降低从而导致更多姜黄素还未来得及给出氢原子就泄露到缓冲溶液中或发生降解。因此当壳聚糖质量分数在0.5%～0.7%时，姜黄素对DPPH自由基的清除能力也有了相应的减小。

4 结束语

本文旨在研究不同质量分数壳聚糖修饰脂质体对姜黄素的包载作用。采用薄膜蒸发法制备姜黄素脂质体，然后将姜黄素脂质体与不同质量分数的壳聚糖（0.1%～0.7%）按照1∶1的体积比进行混合。通过研究得知壳聚糖修饰的脂质体对姜黄素有较强的保护作用，能提高姜黄素的稳定性以及抗氧化能力。随着壳聚糖质量分数的增大，存在最佳的壳聚糖修饰质量分数（0.4%）使得壳聚糖修饰脂质体对姜黄素的保护作用最强，在此最佳条件下姜黄素的稳定性、抗氧化能力最高。当壳聚糖浓度太大时会导致姜黄素脂质体体系产生絮凝、沉降，降低体系的稳定性以及对姜黄素的保护作用，从而导致姜黄素的稳定性及抗氧化能力的降低。

参考文献

[1] 杨永安，张凯，唐红军，等. 水环境中揮发性有机物的监测方法[J]. 四川环境，2014，33（3）：108-112.

[2] LIAN T， HO R J. Trends and developments in liposome drug delivery systems[J]. J Pharm Sci，2001，90（6）：667-680.

[3] CARTEL L， CERUTI M， DOSIO F. From conventional to stealth liposomes： a new frontier in cancer chemotherapy[J]. Tumor，2003，89（3）：237-249.

[4] TAKAHASHI M， UECHI S， TAKARA K， et al. Evaluation of an oral carrier system in rats： bioavailability and antioxidant properties of liposome-encapsulated curcumin[J]. J Agr Food Chem，2009（57）：9141-9146.

[5] WANG Y J， PAN M H， CHENG A L， et al. Stability of curcumin in buffer solutions and characterization of its degradation products[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis，1997，15（12）：1867-1876.

[6] LI L， ZHANG Y， HAN S， et al. Penetration enhancement of lidocaine hydrochlorid by a novel chitosan coated elastic liposome for transdermal drug delivery[J]. J Biomed Nanotechnol，2011（7）：704-713.

[7] JOVANOVIC S V， STEENKEN S， BOONE C W， et al. H-atom transfer is a preferred antioxidant mechanism of curcumin[J]. Journal of the American Chemical Society，1999（121）：9677-9681.

[8] BARRY J， FRITZ M， BRENDER J R， et al. Determining the effects of lipophilic drugs on membrane structure by solid-state NMR spectroscopy： The case of the antioxidant curcumin[J]. Journal of the American Chemical Society，2009（131）：4490-4498.

[9] 吴斌. 水溶性壳聚糖修饰甘草酸脂质体的制备及其释药性能的研究[D]. 武漢：武汉理工大学，2009.

[10] 陈雄. 壳聚糖溶液行为研究[D]. 北京：北京服装学院，2008.

[11] WANG F， YANG J， WU X， et al. Investigation of the interaction between curcumin and nucleic acids in the presence of CTAB[J]. Spectrochim Acta，2007（67）：385-390.

[12] WANG F， WU X， WANG F， et al. The sensitive fluo

rimetric method for the determination of curcumin using the enhancement of mixed micelle[J]. J Fluoresc，2006（16）：53-59.

[13] TAN C， XUE J， KARANGWA E， et al. Dual effects of chitosan decoration on the liposomal membrane physicochemical properties as affected by chitosan concentration and molecular conformation[J]. J Agr Food Chem，2013（61）：6901-6910.

[14] PRIYADARSINI K I， MAITY D K， NAIK G H， et al. Role of phenolic O-H and methylene hydrogen on the free radical reactions and antioxidant activity of curcumin，Free Radical Bio[J]. Med，2003（35）：475-485.

[15] KIM K W， THOMAS R L. Antioxidative activity of chitosans with varying molecular weights[J]. Food Chemistry，2007，101（1）：308-313.

（编辑：莫婕）