新疆昭苏县马梨形虫的检测及传播媒介蜱的鉴定

图尔荪·萨迪尔，李　佳，王振宝，宋瑞其，巴音查汗*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆阿克苏地区动物疫病控制诊断中心，新疆阿克苏 843000；3.新疆伊犁出入境检验检疫局，新疆伊宁 835000)



新疆昭苏县马梨形虫的检测及传播媒介蜱的鉴定

图尔荪·萨迪尔1，李佳2，王振宝3，宋瑞其1，巴音查汗1*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆阿克苏地区动物疫病控制诊断中心，新疆阿克苏 843000；3.新疆伊犁出入境检验检疫局，新疆伊宁 835000)

摘要：为了解新疆昭苏县马感染梨形虫情况及传播媒介蜱的种类，采用寄生虫病病原常规检查方法、分子生物学技术和血清学检测方法对200匹马进行马梨形虫的检测，对320只传播媒介蜱进行形态学鉴定。结果显示，血液涂片染色镜检红细胞染虫率为9.23%，PCR、cELISA对驽巴贝斯虫的检出率分别为28%和23.5%，对泰勒虫的检出率分别为36%和34%；对马体表和周边环境采集的320只蜱虫鉴定为草原革蜱和森林革蜱2种。本研究为该地区马梨形虫病的防控提供了科学依据。

关键词：马；泰勒虫；驽巴贝斯虫；蜱；鉴定

马梨形虫病是马驽巴贝斯虫或马泰勒虫所引起的马属动物的一种血液原虫病，临床特点是急性溶血性贫血、黄疸、厌食，偶尔出现腹痛、便秘、腹泻等消化道症状[1-9]。据报道马梨形虫也可经胎盘感染，导致母马流产或胎儿感染，但这种情况少见[10]。

在马梨形虫病流行的一些地区和国家，新出生的马驹通过初乳得到的母源抗体从而具有抗感染能力。马感染梨形虫主要通过在携带病原蜱虫大量兹生的区域放牧而感染，携带病原的蜱虫在叮咬马匹吸血时，病原体通过蜱的唾液腺进入马匹体内而感染马。马梨形虫病有明显的季节性， 一般发病率高，如不及时治疗，很快就死亡[11]。因此，本研究通过采用寄生虫病病原常规检查方法、分子生物学技术和血清学检测方法对昭苏县马梨形虫进行检测，并对传播媒介硬蜱进行鉴定。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品2015年6月至2015年11月在昭苏县采集了马抗凝血和血清各200份，蜱虫共320只。

1.1.2主要仪器和材料PCR仪、 Gel Doc2000紫外凝胶成像系，美国Bio-Rad公司产品；电子显微镜、Blood Genome DNA Exraction Kit，上海TaKaRa公司产品；马驽巴贝斯虫和马泰勒虫cELISA诊断试剂盒，美国VMRD公司产品，批号分别为P140327-001和P140326-001。

1.2方法

1.2.1血液涂片染色镜检采血，滴于载玻片的一端，推制成血片，并使晾干。滴甲醇2滴～3滴于血膜上，使其固定，然后用瑞特-姬姆萨复合染料染色，晾干后镜检。

1.2.2马梨形虫的PCR检测按照Blood Genome DNA Exraction Kit的说明书对200份马抗凝血提取DNA，引物参考已发表的泰勒虫18 S RNA和驽巴贝斯虫BC-48基因序列[12]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

BC-48-F：5′-GCGACGTGACTAAGACCTTA- TTGG-3′；BC-48-R：5′-GTTCTCAATGTCAGT- AGCATCCGC-3′；TE-18S-F：5′-TTTGGGCTGT- TTACAGTTGC-3′；TE-18S-R： 5′-CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG-3′。

以提取的马全血DNA为模板，用PCR方法进行马泰勒虫和驽巴贝斯虫病的检测。

1.2.3马梨形虫抗体检测按照马cELISA试剂盒的操作说明书对分离的马血清进行马梨形虫病抗体的检测，测量各孔的吸光度值，并计算平均值，判定结果。检测有效性：0.300<阴性OD值<2.00，有效；阴性判定：当0.300<样品OD值<2.00时，马驽巴贝斯、马泰勒虫均为阴性；阳性判定：当样品OD值<标准阴性平均值时，马驽巴贝斯、马泰勒虫均为阳性。

1.2.4体表蜱虫的鉴定

1.2.4.1蜱虫的形态学初步鉴定对所采集的蜱虫进行清洗处理，肉眼从外观特征上初步分类，其中一部分用750 mL/L的酒精固定，一部分在解剖镜下观察鉴定，一部分制成玻片标本分类鉴定。

1.2.4.2蜱虫的显微结构鉴定蜱虫玻片标本制作方法：先将蜱用100 g/L的NaOH水溶液煮沸数分钟(大的虫体，需用昆虫针在虫体上刺个小洞)，直至虫体软化透明即可，然后将虫体放入清水中洗去碱液。洗净后的虫体依次经过300、500、700、900、1000 mL/L的酒精和1∶1的无水酒精二甲苯及纯二甲苯各1 h，然后用树胶封片。对已干涸的标本要先洗润，再放入NaOH液中浸泡，然后脱水透明，最后在镜下进行鉴定。在解剖镜下依照属和种的检索表对采集的蜱进行鉴定及分类。借助解剖镜观察蜱虫的假头基、基突、须肢、盾板、侧沟、生殖孔、足基节、足转节、肛沟和气门板等形态学特征。1.2.4.3蜱虫的超微结构鉴定将活蜱用热水烫死后立即放于25 mL/L戊二醛溶液中，在4℃下固定2 d。用pH 7.2磷酸缓冲液换洗3次，然后用不同浓度的酒精逐级脱水，再用真空干燥仪干燥，最后用导电胶将标本固定在样品台上，进行喷金，扫描电镜下观察蜱虫的形态。

2　结果

2.1血液涂片染色镜检结果

对昭苏县200份马血液进行血液涂片镜检。一般马驽巴贝斯虫虫体长度大于红细胞半径，且呈尖端连成锐角，而马泰勒虫虫体长度小于红细胞半径。

经镜检检测出了马泰勒虫和马驽巴贝斯虫，红细胞染虫率为9.23%(图1)。

图1　血液图片镜检结果

2.2PCR检测结果

对提取的200份核酸样品采用PCR方法进行检测，结果显示马驽巴贝斯虫和马泰勒虫感染率分别为28%和36%，混合感染率为16%(表1)。

取适量PCR产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示马努巴贝斯虫阳性条带为452 bp，马泰勒虫阳性条带为142 bp。电泳结果见图2和图3。

表1　昭苏县马梨形虫感染率

M.DNA标准DL 1 000；1.阳性对照；2.阴性对照；3～24.样品

M.DNA标准DL 1 000；1.阳性对照；2.阴性对照；3～24.样品

2.3cELISA检测结果

cELISA检测显示，马驽巴贝斯虫阳性率为23.5%，马泰勒虫阳性率为34.0%,样品结果如表2。

表2　cELISA检测结果

2.4体表蜱虫鉴定结果

2.4.1蜱虫的形态学初步鉴定结果共采集鉴定昭苏县马匹体表蜱虫共320只，经形态学鉴定初步鉴定为草原革蜱和森林革蜱2种，属于硬蜱科革蜱属，其中232只为雌蜱，88只为雄蜱，未吸血的190只。

2.4.1.1草原革蜱雌蜱基突很短或不明显，假头基矩形；孔区较大，卵圆形，向外斜置，间距小于其短径。气门板椭圆形。足基节Ⅳ外距末端不超过或平齐于该节后侧缘。雄虫体卵圆形；基突宽短；假头基呈矩形，须肢宽短，足基节Ⅳ向后方显著伸长，其外距不超过该节后侧缘，足转节Ⅰ背距短，末端圆钝，气门板背突较直而短，见图4。

2.4.1.2森林革蜱雌蜱孔区较大呈卵圆形；假头基呈矩形，须肢第3节背面近似三角形，前端向外斜置。气门板背突窄短，末端圆凸；基节Ⅳ外距末端超出该节后缘，足基节Ⅰ内距很宽，外距逐渐细窄，外距比内距稍长或等长。雄蜱须肢粗短，假头基呈矩形，宽稍大于长，足基节Ⅳ外距明显，末端超出该节后缘，足转节I背距呈三角形，末端尖细。气门板逗点形，背突末端伸达盾板边缘，见图5。

2.4.2蜱虫的显微结构鉴定结果

2.4.2.1草原革蜱超微结构雌蜱假头基矩形，后缘平直，基突很短；孔区较大，卵圆形，向外斜置；间距小于其短径，生殖孔有翼状突；气门板椭圆形；足基节Ⅳ外距末端不超过或平齐于该节后侧缘。雄蜱假头基呈矩形，须肢宽短；气门板逗点形，背突较直而短，末端不到盾板边缘；腹面内侧缘第1节有刚毛，第2节无刚毛；足基节Ⅳ向后方显著伸长，其外距不超过该节后侧缘，足转节Ⅰ背距短，末端圆钝，详见图6。

2.4.2.2森林革蜱超微结构雌蜱假头基矩形，后缘平直，基突短而钝，孔区大呈卵圆形，向外斜置，孔区内刚毛数量也为1根，位于孔区内侧中部，气门板背突窄短，末端圆凸；第1 对足基节的外距短于内距，生殖孔的翼状突很明显，呈“V”形，第4 对足基节外距超出该节后侧缘，雄蜱假头基呈矩形，宽稍大于长，气门板逗点形，背突窄短，见图7。

3　讨论

昭苏作为一个养马大县，在国家的相关政策扶持下马产业蒸蒸日上，逐渐由最初的交通运输、农耕役用和军马的传统马业转变为集比赛、马术、旅游娱乐和食用为一体的现代马产业[13]。昭苏县的气候、植被等生态条件非常适宜马匹生长、繁衍，可谓是“牧马的天堂”。由于马属动物是多种寄生虫的自然宿主，饲养管理过程中常因虫体的寄生造成宿主生长发育受阻、被毛杂乱、精神委靡靡等一系列慢性病症，严重时可致死，造成巨大的经济损失。寄生虫病的地方性流行成为现阶段严重困扰新疆马产业健康发展的重要因素之一。

调查结果显示，血涂片红细胞染虫率为9.23%，PCR、cELISA等对驽巴贝斯虫的检出率分别为28%和23.5%，对泰勒虫的检出率分别为36%和34%。血液涂片虽然方便直观，多用于急性病例检测，但其主观性大；cELISA多用于检测抗体，该方法虽然快速有效，适合高通量检测，但是对于病畜感染还不能有效界定； PCR法检测病原精准而快捷，因此PCR方法检测出的数据更为准确。根据调查结果可知该地区马梨形虫的感染情况较严重，会影响当地马养殖业的发展，应引起有关部门的重视。为降低该病的发生率，应积极采取药物防控措施，以便有效降低马匹感染该病，同时也提高人们对蜱传疾病的认识，做好防治蜱虫的工作对预防血液原虫病的发生，此次流行病学调查结果为当地防治蜱传疾病提供了科学依据。

A.♀背面；B.♂背面；C.♀基节Ⅳ内外距；D.♂气门板

A.♀背面； B.♂背面； C.♂腹面； D.♂气门板

A.口下板齿式(100×)；B.生殖孔(40×)；C.基节Ⅳ外距(100×)；D.基节Ⅳ内距(100×)；E.♂气门板；F.孔区刚毛(100×)

A.Hypostomal dentition formula(100×)；B.Gonopore(40×)；C.Coxal Ⅳof external spur(100×)；D.Coxal Ⅳof internal spur(100×)；E.♂Spiracular plate；F.Porose areal setae(100×)

图6草原革蜱超微结构

Fig.6Ultrastructure ofD.nuttalli

A.基节Ⅳ外距(40×)； B.♀气门板(40×)；C.生殖孔(40×)；D.孔区刚毛(100×)；E.口下板齿式(100×)

A.External spur of coxa Ⅳ(40×)；B.♀Spiracular plate(40×)；C.Gonopore(40×)；D.Porose areal setae(100×)；E.Hypostomal dentition formula(100×)

图7森林革蜱超微结构

Fig.7Ultrastructure ofD.silvarum

参考文献:

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收稿日期：2016-01-15

基金项目：新疆维吾尔自治区产学研联合培养研究生示范基地联合培养研究生项目(xjaucxy-yjs-20151017);国家自然基金委-新疆联合基金项目(U1403282)

作者简介：图尔荪·萨迪尔(1989-)，男(维吾尔族)，新疆克州人，硕士研究生，主要从事预防兽医学研究。*通讯作者

中图分类号:S852.723

文献标识码:A

文章编号:1007-5038(2016)07-0044-05

Detection of Equine Piroplasma and Identification of Vector Ticks in Zhaosu County of Xinjiang

TUERSUN·Sadier1，LI Jia2，WANG Zhen-bao3，SONG Rui-qi1，Bayinchahan1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China；2.AksuCenterforAnimalDiseaseControl，Aksu，Xinjiang， 843000，China；3.YiliEntry-exitInspectionandQuarantineBureau，Yining，Xinjiang，835000，China)

Abstract:In order to understand the infection situation of equine piroplasma and spread of vector tick species in Zhaosu county of Xinjiang,the blood smear routine inspection method,molecular biology technology and serological detection method were used to detect 200 horses and 320 vector ticks.The results showed that the infective rate of erythrocytes is 9.23%.Babesia caballi detection rates by PCR and cELISA are respectively 28% and 23.5%.Theileria detection rates are respectively 36% and 34%.The 320 ticks collected from horses and surrounding environment were identified as D.nuttalli and D.silvarum.This study provided scientific basis for the prevention of the equine piroplasmosis in the area.

Key words:horse; Theileria equi; Babesia caballi; tick; identification