固相萃取-高效液相色谱法同时测定番茄酱中4种苏丹红染料

陈波

(宁波市北仑区疾病预防控制中心 检验科，浙江 宁波 315800)

固相萃取-高效液相色谱法同时测定番茄酱中4种苏丹红染料

陈波Δ

(宁波市北仑区疾病预防控制中心 检验科，浙江 宁波 315800)

目的建立固相萃取-高效液相色谱法同时测定番茄酱中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。方法样品用乙腈∶三氯甲烷(v/v)=3:1提取，经ProElut SDH固相萃取柱净化，以乙腈和0.2%磷酸溶液为流动相，经梯度洗脱分离，在500nm波长下进行检测，外标法定量。结果苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ在0.1～20 μg/mL 浓度范围内的加标回收率在83.4%～94.6%，其相对标准偏差(RSD)为2.9%～5.4%，在0.1～20.0 mg/L范围呈现良好的线性，其回归系数大于0.999，检出限(LOD)分别为苏丹红Ⅰ 4 μg/kg、苏丹红Ⅱ 8 μg/kg、苏丹红Ⅲ 4 μg/kg、苏丹红Ⅳ 5 μg/kg。结论该方法简便、灵敏、重现性好，能满足番茄酱中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ残留的检测需要。

高效液相色谱；固相萃取；番茄酱；苏丹红染料

苏丹红是一种化学染色剂，它的化学成份中含有一种叫萘的化合物，该物质具有偶氮结构，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4种类型。一般不溶于水，易溶于有机溶剂，由于这种化学结构的性质决定了它具有致癌性，对人体的肝肾器官具有明显的毒性作用。苏丹红属于化工染色剂，主要是用于石油、机油和其他的一些工业溶剂中，目的是使其增色，也用于鞋、地板等的增光。 近年来苏丹红染料被部分违法商家添加到食品表面着色以改善感官度[1]。据世界卫生组织的国际癌症研究机构(IARC)1995年确定，苏丹红属第三类致癌物质。如果长期大剂量摄入会增加人体致癌的危险性。欧盟国家已在1995年禁止其作为食用色素，我国在《食品添加剂使用卫生标准》中也禁止将苏丹红作为食品添加剂使用[2]。

番茄酱是西餐中的一种重要调味品，是增色、添酸、助鲜、郁香的调味佳品。国内对辣椒酱中苏丹红染料的检测有较多报道，但番茄酱较少。苏丹红的分析主要采用高效液相色谱法[3-4]、气质联用法[5]、液质联用法、酶联免疫吸附法[6]、薄层色谱法等，这些方法有的前处理过程复杂、检测时间长、检测费用高、仪器设备贵，有的灵敏度低、有的检测组分单一。固相萃取-高效液相色谱法检测苏丹红染料的方法具有简单、灵敏度高和稳定性好等特点，能够满足批量样品检测的工作要求。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：安捷伦1260型高效液相色谱仪，包括紫外检测器(G1314F)、四元泵(带真空脱气机)(G1311C)、柱温箱(G1316A)，自动进样器(G1329B)和Agilent色谱工作站；德国Sigma 3K-15型离心机 ；瑞士buchi R-200旋转蒸发仪；优普纯水仪；电子天平(Precisa公司)；氮吹仪(天津奥特塞恩斯MTN-2800D)

1.1.2 试剂：苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对照品 (含量>99.0 %，Chem Service公司)；乙腈(美国天地公司，色谱纯)、正己烷、三氯甲烷(天津四友，色谱纯)；磷酸(AR)；SPE柱净化：ProElut SDH 500 mg/6 mL(迪马科技)，聚四氟乙烯滤膜(0.45 μm)。

苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的标准贮备液(1.0 mg/mL)：分别准确称取0.0100 g苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准品于10 mL容量瓶中，分别用少量乙腈溶解后，并用乙腈定容至刻度。配制成1.0 mg/mL的标准储备溶液，使用前逐级稀释。

番茄酱样品。来自于市场上购买的若干份各种品牌的番茄酱。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱：Agilent Eclipse-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)，0.2%磷酸(B)，梯度洗脱程序：其中A：80%；10.00 min，85%；15.00 min，100%；20.00 min，100%；21.00 min，80%，后运行时间3.00 min。流速1.0 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL；检测波长为500 nm。

1.2.2 样品的提取：称取10 g(精确到0.01 g)番茄酱于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈∶三氯甲烷(v/v)=3:1，匀浆，超声5 min，10 000 r/min离心5 min，上清液移入旋转蒸发瓶，残渣用20 mL乙腈:三氯甲烷(v/v)=3:1重复提取1次，合并上清液于旋转蒸发瓶中，旋转蒸发近干，加5 mL正己烷溶解，过ProElut SDH 苏丹红检测专用固相萃取柱：用5 mL正己烷活化；加入待净化液，弃去流出液；依次加入5 mL正己烷，5 mL 1%乙酸乙酯正己烷，弃去流出液；加入10 mL 30%乙酸乙酯正己烷，收集流出液；将洗脱液在40 ℃下减压蒸馏近干，用乙腈溶液定容至1 mL，用0.45 μm滤膜过滤后供HPLC分析。

1.2.3 提取溶剂的选择：苏丹红为油溶性的物质，食品中苏丹红染料检测的相关报道中提取溶剂通常有乙腈、丙酮和正己烷等。本研究分别选用了乙腈、正己烷、三氯甲烷、乙腈-三氯甲烷(v/v=3:1)4种提取溶剂对番茄酱中的苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ进行提取，结果显示，乙腈-三氯甲烷(v/v=3:1)的提取效率最高。

1.2.4 净化方法的选择：国内文献报道苏丹红染料前处理有直接过滤膜上机，凝胶渗透色谱(GPC)[7]，中性氧化铝固相萃取小柱[8]等。直接过滤膜上机，前处理方法简单，但由于番茄酱中基质复杂，提取后仍存在大量干扰物质，影响色谱柱寿命。凝胶渗透色谱(GPC)净化，净化效果好，样品洁净无杂峰干扰，但GPC价格昂贵又需要专人维护，不易普及。中性氧化铝固相萃取柱回收率平行结果偏差大。迪马ProElut SDH固相萃取柱(6mL)，可保持高保留性能和重现性，各组分的吸附、洗脱、回收均较为理想。

1.2.5 方法标准曲线、检出限及定量限：取4种苏丹红染料标准品，分别配制成质量浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的系列标准溶液。按上述色谱条件检测，每个浓度重复3次，峰面积取平均值。得到标准溶液浓度X与峰面积Y之间的工作曲线。

1.2.6 精密度与加标回收率：在番茄酱中添加高、中、低3个浓度，每个添加水平重复测定6次，计算平均加标回收率和精密度(RSD)。

1.2.7 样品检测：对番茄酱样品进行检测得到加标色谱图，与苏丹红混合标准的色谱图比较。

2 结果

2.1 方法标准曲线、检出限及定量限 4种苏丹红染料的标准溶液浓度X与峰面积Y之间的工作曲线，相关系数都在0.999以上。按本方法测定结果，以3倍信噪比(S/N)确定分析物的检出限，10倍信噪比(S/N)为定量限。回归方程、相关系数以及定量的限详见表1。

表1 标准曲线及检出限

2.2 精密度与加标回收率 平均加标回收率和精密度(RSD)，见表2。结果表明，4种苏丹红染料添加回收率在83.4～94.6%，相对标准偏差(RSD)为2.9%～5.4%。说明该方法具有较好的精密度和回收率，可以满足痕量分析要求。

表2 番茄酱中苏丹红的加标回收率和精密度(n=6)Tab.2 The recovery and precision of tonyred in ketchup(n=6)

2.3 样品检测结果 对番茄酱样品进行检测，未检出阳性样品。图1给出其中一份苏丹红混合标准的色谱图1和该样品的加标色谱图2。

图1 苏丹红混合标准色谱图Fig.1 The standard chromatogram of tonyred

图2 番茄酱中苏丹红加标色谱图Fig.2 The chromatogram of sample-adding tonyred in ketchup

3 结论

通过优化提取溶剂、样品净化等前处理建立了高效液相色谱，同时测定番茄酱中4种苏丹红染料的残留量。本文建立了固相萃取-反相高效液相色谱法同时测定番茄酱中苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ，其灵敏度、精密度、准确度都可达到要求，可作为常规分析的检测方法。

[1] 李勇竞.高效液相色谱法快速测定辣椒酱中的苏丹红[J].安徽预防医学杂志，2010，16(5)：354-356.

[2] 曹起灵，李锐，方忠意，等.超高效液相色谱法测定饲料中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的含量[J].饲料工业，2008，29(12)：61-62.

[3] GB/T 19681—2005.食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法[S].

[4] 周建科, 刘瑞英, 李晓阳. 山楂饴中苏丹红的高效液相色谱法测定[J] .现代食品科技,2009, 25(2):208-210.

[5] 林佶，万玉萍，沈其萍，等．GC/MS定性定量分析食品中的苏丹红Ⅰ号[J]．职业与健康，2006，22(22):45-46.

[6] 唐甬,据春梅,魏钟杰,等. 苏丹红Ⅰ、Ⅲ和对位红竞争ELISA检测方法的初步建立[J].食品科学,2008,29(8):523-525.

[7] 宋欢，连庚寅，杜丽君，等.凝胶渗透色谱-液相色谱法测定辣椒及其制品中的对位红和苏丹红[J].食品科学，2006，27(12)：611-613.

[8] 王明月，桂卫星，袁宏球，等.HPLC法测定咸蛋、皮蛋黄中的四种苏丹红染料[J].食品科学，2009,30(2)：193-195.

(编校：王俨俨)

SimultaneousdeterminationoffourkindsoftonyredinketchupbySPE-HPLC

CHEN BoΔ
(Department of Laboratory, Beilun Ningbo District Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315800,China)

ObjectiveTo establish simultaneous determination of tonyred Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ in ketchup by solid phase extraction-high performance liquid chromatography (SPE-HPLC).MethodsSamples were extracted by solvent of acetonitrile:trichloromethane (v/v) =3:1, and purified by ProElut SDH. The acetonitrile and 0.2% phosphoric acid solution as the mobile phase with gradient elution separation, the detection wavelength was 500nm, quantified by external standard method.ResultsTonyred I, II, III, IV recoveries in 0.1-20 g/mL concentrations ranged at the rate of 83.4%-94.6%, the relative standard deviation (RSD) ranged from 2.9% to 5.4%, showed a good linear range of 0.1-20.0 in mg/L, the regression coefficient was greater than 0.999, the limit of detection (LOD) respectively as tonyred I 4 μg/kg, tonyred II 8 μg/kg, 4 μg/kg tonyred tonyred III, IV 5 μg/kg.ConclusionThe method is simple, sensitive, reproducible, can meet the tonyred I, II, III, IV requires detection of residues.

high performance liquid chromatography; solid phase extraction; ketchup; tonyred dye

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.045

陈波，通信作者，女，本科，研究方向：检验，E-mail：chenbozj1979@163.com。

TQ617.1；R155.5+1

A