菜青虫感染金龟子绿僵菌后体内几种保护酶活性的变化

李世广,　窦婷婷,　付小伶,　刘祝琴,　何　超

(安徽农业大学植物保护学院, 合肥　230036)



菜青虫感染金龟子绿僵菌后体内几种保护酶活性的变化

李世广*,窦婷婷,付小伶,刘祝琴,何超

(安徽农业大学植物保护学院, 合肥230036)

为了明确菜青虫感染金龟子绿僵菌后体内的防御机制,采用分光光度法测定了菜青虫被金龟子绿僵菌感染后体内保护酶活性的变化。结果表明,用金龟子绿僵菌处理后菜青虫体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)均呈现先上升后下降趋势,反映出菜青虫在金龟子绿僵菌侵染初期防御能力增强,后期降低。其中,SOD、POD和CAT活力分别在接种后36、24和48h达到高峰,说明菜青虫在抵抗金龟子绿僵菌侵染过程中,首先发生作用的保护酶是POD,随后为SOD,而CAT是最后发生作用的保护酶。

菜青虫;金龟子绿僵菌;超氧化物歧化酶;过氧化物酶;过氧化氢酶

LiShiguang,DouTingting,FuXiaoling,LiuZhuqin,HeChao

菜青虫为鳞翅目粉蝶科菜粉蝶(Pieris rapae)的幼虫,是十字花科植物的重要害虫,除啃食叶肉为害之外,还可引起软腐病的流行,危害十分严重[1]。

目前,我国对于农业害虫的防治还集中于化学防治上,但大量化学农药的使用已经使得环境不堪重负,在害虫产生抗药性的同时,大量的农药残留也对人类自身的健康产生极大的威胁。因此,寻找能够有效防治农业害虫的生物方法显得尤为重要。绿僵菌[Metarhizium (Metsch.)Sorokin]是一类广谱性虫生真菌,能侵染200多种农林害虫,对人、畜、作物安全[23]。国内外运用绿僵菌防治农业害虫的研究已有不少报道[4],有关昆虫保护酶的研究报道也有很多,但大多数还集中在昆虫保护酶与昆虫抗药性关系之间的研究[57]。关于昆虫病原真菌与昆虫保护酶关系的研究也略有报道[810]。而被绿僵菌侵染后菜青虫体内保护酶活性变化尚未见报道。

以往的研究表明,菜青虫体内存在着超氧化物歧化酶(superoxide,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和过氧化物酶(peroxidase,POD)等保护酶。当昆虫病原真菌附着在菜青虫体壁,菌丝进入血腔后,菜青虫会启动机体内的保护酶系统进行防御,即菜青虫体内的SOD、CAT和POD三者协同作用, 使自由基维持在一个较低的水平,从而维持其正常的生理活动[11]。作者利用筛选出的对菜青虫致病力较高(校正死亡率为96.4%,僵虫率达84.1%,LT50为2d,尚未发表)的金龟子绿僵菌Ma60菌株,研究了被该菌株侵染后菜青虫体内几种保护酶活力的变化,旨在为菜青虫的生物防治工作提供科学依据。

1　材料与方法

1.1供试菌株

金龟子绿僵菌Ma60菌株,由安徽农业大学植物保护学院生物防治研究室提供。

1.2供试虫源

菜青虫采自安徽农业大学农翠园,将其放在安徽农业大学植保学院大棚温室内的白菜上饲养,待成虫产卵孵化后转为室内盆栽白菜饲养,选取健康活泼的4龄幼虫供试。

1.3真菌分生孢子悬浮液配制

将Ma60菌株接种于PDA培养基平板上,在 (25±1)℃ 条件下培养 10d,待真菌充分产生孢子后,将分生孢子粉刮到盛有 10mL0.1%Tween-80湿润剂的试管中,在涡旋混匀器上充分振荡 30min,用血球计数板计数,配制成孢子含量1.0×108个/mL的分生孢子悬浮液。

1.4金龟子绿僵菌对菜青虫的侵染试验

将20头4龄菜青虫放入培养皿中,用简易喷雾器将含0.1%Tween-80的1.0×108个/mL的金龟子绿僵菌孢子悬浮液均匀地喷在试虫体表,待虫体晾干后,放入装有白菜叶片的培养皿中,以无菌的0.1%吐温-80溶液为对照，每处理重复3次,置于温度22℃、相对湿度90%左右、光周期L∥D=14h∥10h的恒温光照培养箱内。分别于接菌后12、24、36、48、60、72h取样，备用。

1.5酶液的制备

试虫先用生理盐水漂洗2～3次,并用滤纸去除体表水分。准确称量试虫重量,按1∶9(W/V)加入经过遇冷处理的生理盐水,在冰浴中进行研磨,制成10%组织匀浆液,在4℃下2 500r/min离心10min,取上清液作为待测酶液,放入-20℃冰箱内储藏备用。

1.6酶活性的测定

酶液蛋白含量、SOD、POD和CAT活性测定均按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行。每处理均重复3次,求平均值。

1.7数据处理

采用MicrosoftExcel2003进行数据统计和图表绘制。采用DPS7.05进行方差分析,Duncan新复极差法比较差异显著性。图中数据用平均值±标准误表示。

2　结果与分析

2.1菜青虫体内SOD活性的变化

经金龟子绿僵菌处理后菜青虫体内SOD活性变化如图1所示,测定期间对照组菜青虫体内不同时间的SOD比活力差异不显著。但处理组不同时间的SOD比活力差异极显著(P<0.01),在接菌后12h时略低于对照,随后逐渐升高,到36h达到最高峰,显著高于对照组,酶的比活力为同期对照组的1.6倍。感染36h之后体内SOD活力急剧下降,60h及72h显著低于对照组,分别为对照组的0.83和0.60倍。表明菜青虫被金龟子绿僵菌侵染后12h,孢子还未萌发,菌丝未侵入体内,所以表现为12h时处理组与对照组之间差异不显著。而在接菌后24～36h,O2浓度增加,导致虫体内的HO-浓度大量增加,表现为SOD活力明显上升,以减轻过氧离子对虫体的毒害。在感染后期,可能是受金龟子绿僵菌在虫体内大量繁殖的影响,使得SOD的合成受到抑制,自身防卫能力下降,表现为SOD活力急剧下降并低于正常虫体。

图1　感染金龟子绿僵菌后4龄菜青虫体内SOD活性的变化Fig.1　Changes of SOD activities in the 4th instar of Pieris rapae larvae infected by Metarhizium anisopliae

2.2菜青虫体内POD活性的变化

经金龟子绿僵菌处理后菜青虫体内POD活性的变化如图2所示,在接菌后72h内,对照组菜青虫体内的POD活性无显著变化。而处理组的POD活性呈先升高后下降趋势。其中,菜青虫在染菌后12h,其体内POD比活力与对照组无显著差异;POD活性在接菌后24h时达到最大,显著高于对照组,为对照组的1.34倍;随后缓慢下降,在接菌后36～48h,处理组比活力仍显著高于对照组,随后急剧下降,染菌72h后达到最低,显著低于对照组酶活力。说明菜青虫被金龟子绿僵菌侵染后,其体内可能产生具有毒性的氧化物质,从而启动免疫系统合成POD,以维持其正常的生理功能;但在接菌第24h后,由于金龟子绿僵菌菌丝在菜青虫体内开始萌发,使POD合成受到影响,从而表现为POD活性逐渐下降。

图2　感染金龟子绿僵菌后4龄菜青虫体内POD活性的变化Fig.2　Changes of POD activities in the 4th instar of Pieris rapae larvae infected by Metarhizium anisopliae

2.3菜青虫体内CAT活性的变化

经金龟子绿僵菌处理后菜青虫体内CAT活性的变化如图3所示,对照组菜青虫随着虫体的生长发育CAT活性无显著变化。而处理组的CAT活性在接菌后变化较大。接菌后12～24h,菜青虫CAT活性与对照相比,无显著差异。从接菌后24h开始,CAT活力显著上升,由20.374U/mg上升至26.798U/mg,随后缓慢上升至30.687U/mg(48h),达到最高峰,为对照组的1.55倍。但在接菌48h后缓慢下降,直至72h时略低于对照,且差异不显著。表明在金龟子绿僵菌侵染初期,菜青虫体内组织暂时未受到侵染,因而CAT的活力没有发生明显的变化;而在侵染后期,虫体组织遭受严重侵染,因此菜青虫体内的CAT活性提高以抵御病原菌对虫体产生的毒害;但由于金龟子绿僵菌在虫体内的生长繁殖速度很快,最终超出其抵御能力，导致菜青虫的CAT活力逐渐下降。

图3　感染金龟子绿僵菌后4龄菜青虫体内CAT活性的变化Fig.3　Changes of CAT activities in the 4th instar of Pieris rapae larvae infected by Metarhizium anisopliae

3　讨论

本试验结果表明,菜青虫被金龟子绿僵菌侵染后体内的SOD、POD和CAT酶活性均呈现先升高后降低趋势。这与李会平等[9]、姬国红等[15]的报道一致。表明金龟子绿僵菌能有效地干扰菜青虫体内保护酶的活性,出现这种结果,可能是由于菜青虫被金龟子绿僵菌侵染后,其体内产生有毒的氧化物质,从而刺激虫体免疫系统合成相应的保护酶,以抵御有毒物质对虫体的毒害,进而维持昆虫体内正常的生理活动;而随着感染时间的延长,金龟子绿僵菌在虫体内大量繁殖,破坏了虫体组织,菜青虫保护酶的合成机制受到限制,清除自由基的能力降低,或者是由于感病虫体内自由基过多,自由基产生与清除之间失去平衡,从而引起昆虫发病甚至死亡。从试验结果来看,SOD、POD和CAT活力分别在感染后36、24和48h达到最高峰,说明菜青虫体内的保护酶在对金龟子绿僵菌的免疫过程中,首先发生作用的保护酶是POD,随后为SOD,而CAT是最后发生作用的保护酶。

综上所述,用金龟子绿僵菌侵染菜青虫,能诱导其体内保护酶的活性发生变化,对菜青虫的生物防治具有一定的意义。本文为探明被金龟子绿僵菌感染后菜青虫体内的防御机制提供了一定的理论依据,但是为了更好地研究金龟子绿僵菌对菜青虫的作用机制及菜青虫体内保护酶的作用方式,还需从分子角度对其进行深入探究。

[1]洪晓月, 丁锦华. 农业昆虫学[M]. 第2版. 北京:中国农业出版社, 2008:225.

[2]蒲蛰龙, 李增智. 昆虫真菌学[M]. 合肥:安徽科学技术出版社, 1996.

[3]ErlerF,AtesAO.Potentialoftwoentomopathogenicfungi, Beauveria bassianaandMetarhizium anisopliae (Coleoptera:Scarabaeidae),asbiologicalcontrolagentsagainsttheJunebeetle[J].JournalofInsectScience, 2015, 15(1):44.

[4]林华峰. 虫生真菌研究进展(综述)[J]. 安徽农业大学学报, 1998, 25(3):251254.

[5]高新菊, 沈慧敏. 二斑叶螨对甲氰菊酯的抗性选育及解毒酶活力变化[J]. 昆虫学报, 2011, 54(1):6469.

[6]柳小青, 刘仰青, 熊志伟, 等. 氯氰菊酯和残杀威亚致死剂量对致倦库蚊羧酸酯酶活性的影响[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2011,22(4):309312.

[7]马义, 霍新北, 马民, 等. 氯氟氰菊酯对德国小蠊保护酶活性的影响及新型防治策略研究[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2009, 20(4): 303306.

[8]刘烁安, 符悦冠, 黄武仁, 等. 螺旋粉虱感染蜡蚧轮枝菌对其保护酶和解毒酶活性的影响[J]. 植物保护, 2013, 39(3):711.

[9]李会平, 黄大庄, 苏筱雨, 等. 桑天牛幼虫感染白僵菌后体内主要保护酶活性的变化[J]. 蚕业科学, 2007, 33(4):634636.

[10]张仙红, 王宏民, 李文英, 等. 菜青虫感染玫烟色拟青霉后血淋巴蛋白质含量及几种保护酶活力的变化[J]. 昆虫学报, 2006, 49(2):230234.

[11]李周直, 沈惠娟, 蒋巧根, 等. 几种昆虫体内保护酶系统活力的研究[J]. 昆虫学报, 1994, 37 (4):399403.

[12]ArakawaT.Superoxidegenerativereactionininsecthaemolymphanditsmimicmodelsystemwithsurfactantsin vitro [J].InsectBiochemistryandMolecularBiology, 1995, 25(2):247253.

[13]NappiAJ,VassE,FreyF,etal.SuperoxideaniongenerationinDrosophiladuringmelanoticencapsulationofparasites[J].EuropeanJournalofCellBiology, 1995, 68(4):450456.

[14]李毅平, 龚和. 昆虫体内抗氧化系统研究进展[J]. 生命科学, 1998, 10(5):240243.

[15]姬国红, 钱秀娟, 刘长仲, 等. 夜蛾斯氏线虫对菜青虫几种保护酶活力的影响[J]. 植物保护, 2009, 35(4):6669.

(责任编辑：杨明丽)

ChangesofprotectiveenzymeactivitiesinPieris rapaeinfectedbyMetarhizium anisopliae

(SchoolofPlantProtection,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)

AbstractTounderstandthedefensemechanismsofPieris rapaeagainstMetarhizium anisopliae,thisstudyusedspectrophotometrytoassaytheactivitiesofprotectiveenzymesofP.rapaeinfectedbyM. anisopliae.Theresultsindicatedthat,theactivitiesofSOD,PODandCATintheinfectedP.rapaewereincreasedatinitialinfectionstage,butdroppedatthelaterinfectionstage,suggestingthatthedefensesystemofP.rapaewasenhancedduringinitialperiod,butdroppedduringthelaterperiod.ThehighestactivitiesofSOD,PODandCATwereobservedat36hours, 24hoursand48hoursafterinoculation,respectively,whichindicatedthatPODplayedanimportantroleindefendingagainsttheinvasionofM. anisopliae,andthenSODfunctionedafterinvasion,whilethelasteffectiveprotectiveenzymewasCAT.

Pieris rapae;Metarhizium anisopliae;superoxide;peroxidase;catalase

20150604

20150624

“十二五”农村领域国家科技计划课题(2011BAD12B04-02)；安徽省教育厅重点项目(KJ2015A099)；安徽农业大学学科骨干培育项目(2014XKPY-08)

E-mail:lsg815@163.com

S476.12

ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.022