基于LC-TOF/MS的大鼠尿液中大黄硝石汤原形成分鉴别

谢　瑞，冯　芳,2

(1 中国药科大学药学院，江苏　南京　210009；2 药物质量与安全预警教育部重点实验室(中国药科大学)，江苏　南京　210009)



基于LC-TOF/MS的大鼠尿液中大黄硝石汤原形成分鉴别

谢瑞1，冯芳1,2

(1 中国药科大学药学院，江苏南京210009；2 药物质量与安全预警教育部重点实验室(中国药科大学)，江苏南京210009)

采用高效液相-飞行时间质谱联用(LC-TOF/MS)技术，对大鼠给药大黄硝石汤后尿样中的原形成分进行鉴别。采集正负离子模式下的总离子流图，利用提取离子流技术、结合质谱裂解规律及相关文献，初步推断出尿样中的大黄硝石汤原形成分22种，为进一步研究大黄硝石汤的体内代谢提供基础。

大黄硝石汤；原形成分；高效液相-飞行时间质谱联用

大黄硝石汤首次记载于东汉张仲景所著的《金匮要略》，“黄疸腹满，小便不利而赤，自汗出，此为表和里实，当下之，宜大黄硝石汤”[1]，是湿热黄疸的代表方。其由大黄、芒硝、黄柏、栀子四味药组成，现代药理学研究表明，大黄硝石汤能够降低湿热黄疸大鼠模型血清酶活性、血清总胆红素水平，降低肝脾指数比等，使异常的生理生化指标趋于正常，具有较好的保肝利胆退黄作用[2]。

目前关于大黄硝石汤的研究报道主要集中于其酸碱药对对合煎的影响以及特征成分的含量测定[3-4]，而方剂其他方面的研究目前尚未有更多报道。为了更好的研究大黄硝石汤在体内的作用过程，我们进行了大鼠灌胃大黄硝石汤(18g/kg)后尿液中原形药成分的鉴别，运用LC-ESI-TOF/MS技术，依据保留时间、精密质量和碎片离子等信息，并结合文献对尿样中原形药成分进行归属，为方剂的体内作用过程研究提供更多依据。

1　实　验

1.1主要仪器与装置

Agilent液质联用仪(包括Agilent-1260LC高效液相色谱仪，Agilent-6230飞行时间质谱仪和MassHunterB.04.00软件)，安捷伦公司；AnkeTGL-16B高速离心机，上海安亭科学仪器厂；水浴锅，江苏省医疗器械厂；AB135-S分析天平，美国梅特勒-托利多仪器有限公司；RE-52CS型旋转蒸发仪，上海亚荣升生化仪器厂；高速多功能粉碎机，上海冰都电器有限公司；XW-80A涡旋混合器，上海医科大学仪器厂。

1.2主要材料和试剂

生栀子(产地江西，批号：150627)；大黄(产地甘肃，批号：150410)；黄柏(产地东北，批号：15048)；芒硝(山西，批号：15051)均采购于南京先声药店。大黄为蓼科植物药用大黄RheumofficinaleBaill. (Polygonaceae)的干燥根和根茎；栀子为茜草科植物栀子GardeniajasminoidesEllis(Rubiaceae)的干燥果实；黄柏为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.(Rutaceae)的干燥树皮；硝石为天然硫酸钠经加工精制而成的结晶体。

甲醇(特级纯)，江苏汉邦科技有限公司；纯净水，杭州哇哈哈集团有限公司；冰乙酸(分析纯)，南京化学试剂有限公司；甲酸(分析纯)，南京化学试剂有限公司；乙腈(分析纯)，南京化学试剂有限公司。

1.3动物实验

6只(220±20)gSD大鼠：由南京青龙山动物养殖中心动物饲养。在代谢笼中，水和食物可以自由获得。每只大鼠灌胃给药大黄硝石汤(18g/kg)，收集给药后尿样(0～24h)，4000r/m离心10min后在-20 ℃下保存。

1.4实验条件

1.4.1色谱条件

LichrospherC18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，柱温35 ℃。以甲醇为A相，0.1%甲酸为B相，按如下程序洗脱：0min，5%A；12min，10%A；18min，16%A；27min，20%A；38min，23%A；42min，27%A，保持4min；52min。29%A；66min，40%A；77min，45%A；92min，65%A；99min，80%A；113min，95%A，保持7min；125min，5%A，保持5min。进样量10μL，进样温度4 ℃，DAD波长扫描范围210～600nm，紫外检测波长258nm。

1.4.2质谱条件

干燥气流速10.0L/min；干燥气温度350 ℃；雾化气压力35psig；裂解电压175V、225V；毛细管电压4000V/-3500V；质谱扫描范围：100～1100Da。

质量校正：参比溶液通过参比Nebulizer与样本同时导入离子源进行实时参比，正离子模式下选择离子121.988109和922.009798，负离子模式下选择离子112.985587和1033.988109进行质量校正。

1.5样品制备

1.5.1大黄硝石汤冻干粉的制备

各味药材临用前粉碎，取大黄12g，黄柏12g，栀子9g，加全方10倍量(450mL)的水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮30min，四层纱布过滤；向滤渣中加入450mL水，武火煮沸，文火煎煮30min，四层纱布过滤；向滤渣中加入450mL水，武火煮沸，文火煎煮30min，并在最后加入芒硝12g，溶解后四层纱布过滤；合并三次滤液，放置至室温，旋转蒸发仪减压浓缩(45 ℃，-0.10MPa)，将浓缩后的大黄硝石汤冻干制成冻干粉。

1.5.2尿样前处理

取给药尿样1mL，加入两倍体积(2mL)的4 ℃乙腈。涡旋3min后，12000r/min离心10min，取上清液，35 ℃水浴吹干，用1mL5%甲醇复溶，涡旋3min后，12000r/min离心5min，取适量上清液至进样小瓶中自动进样分析。

2　结果与讨论

2.1尿样前处理方法考察

本实验检测对象为生物样本，生物样品的预处理是体内药物分析的一个重要步骤，样品中含有大量的内源性物质，不仅能与药物及其代谢物结合，且常干扰测定。因此，生物样中的药物必须经过分离、纯化、富集，考虑到鼠尿中主要内源性物质以尿素、尿酸、肌酐等非蛋白含氮有机物为主，同时大黄硝石汤作为复杂体系所含化学成分极性跨度较大，故选用可最大程度保证待测成分完整性的有机溶剂沉淀作为对尿液样本纯化的方法。在比较了甲醇和乙腈作为沉淀剂对于尿样的纯化效果后，最终选定以2倍体积的4 ℃乙腈作为沉淀剂。

2.2质谱结果

图1为大黄硝石汤尿样正负离子两个模式下的总离子流图。由图1可以看出，在所建立的梯度洗脱条件下，大黄硝石汤尿样色谱图中各峰分离良好。

图1　大黄硝石汤尿样总离子流图

2.3尿样中大黄硝石汤原形药成分鉴定

表1列出了大黄硝石汤尿样中检出的原形药成分22个，利用提取离子流并结合质谱裂解规律，同时结合文献可对原形药成分进行归属。在初步确定的成分中可分为：鞣质类，蒽醌类，环烯醚萜类，藏红花苷类，黄酮类及生物碱类，各类结构鉴定分析如表1所示。

表1　大黄硝石汤尿样中原形药成分鉴定Table 1　Identification of xenobiotics of Dahuangxiaoshi Decoction in rat urine

续表1

1041.354549,573,585550.1898225,207Genipin-gentiobioside1143.423356356.1862311Menisperine1247.069411,387388.1369225,207,101Geniposide1349.877356355.1784192Tetrahydropalmatine1465.636338338.1392308Jatrorrhizine1568.636336336.1236321,306,278Berberine1669.703352352.1549336,321Palmatine1777.192609,633610.1534301303Rutin18100.388285286.0477257,241Citreorosein19101.083269,271270.0528239241Aloe-emodin20103.401253254.2579225Chrysophanol21104.818283,285284.0321239,211,183Rhein22108.859269270.0528241,225emodin

2.3.1鞣质类成分

峰1、峰2均产生m/z169碎片离子，同时产生了m/z125的碎片离子，由此推断其结构中有没食子酸结构。其准分子离子[M-H]-分别为m/z331和m/z169，峰1丢失1分子葡萄糖基团(162Da)出现m/z169的碎片离子，参考文献[5]推断峰1为galloyl-glucopyranose。峰2的准分子离子[M-H]-为m/z169，失去一分子CO2得到m/z125的碎片离子，可推断峰2对应的物质为gallicacid。

2.3.2蒽醌类成分

由于蒽醌类化合物用ESI电离容易脱氢而带负电荷，其在负离子扫描模式下会有更好的质谱响应。在负离子模式下，峰19、峰22的准分子离[M-H]-均为m/z269，分子式为C15H10O5，为一对同分异构体。毛细管出口电压为175V时，峰19、峰22的准分子离子[M-H]-分别为m/z269和m/z269，通过增加毛细管出口处的电压至225V时，可发现峰19首先脱掉CHO生成m/z240离子，而峰22首先脱CO生存m/z241离子，后进一步脱O生成m/z225离子。由此可推断峰19、22分别为aloe-emodin和emodin。峰20的准分子离子[M-H]-为m/z253，可脱去1分子CO碎片生成m/z225离子，结合文献[6]，可初步推断峰20为chrysophanol。峰18的裂解则是先脱去1分子CHO生成m/z257离子，再脱O生存m/z241离子，结合其分子离子[M-H]-m/z285，可推断为6-羟基大黄素。峰21有rhein的特征性283→239裂解，其后进一步脱去1分子和2分子CO生存m/z211和m/z183，可推断峰21为rhein。

2.3.3环烯醚萜类

环烯醚萜类化合物是栀子中的主要药效成分，其质谱裂解以糖苷键断裂为主[7]。峰12对应物质在正离子图谱中出现m/z411[M+Na]+加和离子峰，在负离子图谱中出现准分子离子峰m/z387[M-H]-，并脱去一分子葡萄糖基(162Da)生成离子m/z225。毛细管出口处电压提高至225V时，进一步碎裂产生m/z207和m/z101碎片，综合文献[8-9]，可推断峰12对应为geniposide。峰10在其提取离子流谱中出现m/z549[M-H]-，以及m/z573[M+Na]+和585[M+Cl]-的加和离子峰，而其m/z549→m/z225→m/z207的裂解途径与文献报道基本一致，可推断该化合物为genipin-gentioliosde。

峰3的准分子离子峰为m/z391[M-H]-，其进一步碎裂产生m/z229和m/z185，其中m/z229可推断为m/z391脱去一分子葡萄糖结构，m/z185则是进一步脱去一分子CO2后的碎片，可推断峰3为shanzhiside。峰4的分子离子峰为373[M-H]-，其进一步裂解产生m/z211，可推断为丢失一分子葡萄糖基结构的碎片，同时存在m/z747[2M-H]-离子，可推断该峰对应化合物为geniposidicacid。峰5的准分子离子峰m/z403[M-H]-及m/z449[M+HCOO]-加和峰，以及脱去一分子葡萄糖结构生存的m/z241碎片，可推断其对应的化合物为Gardenoside。

2.3.4藏红花苷类化合物

由峰6的一级扫描质谱图可知其准分子离子峰为m/z345[M-H]-，同时其存在加和峰m/z381[M+Cl]-和m/z369 [M+Na]+，其进一步裂解产生m/z165[M-H-Glc-H2O]，可推断为Picrocrocinicacid。

2.3.5黄酮类化合物

峰17的分子离子峰为m/z609[M-H]-，同时有加和离子m/z633[M+Na]+。其正离子模式下脱去一分子鼠李糖结构和一分子葡萄糖结构得到离子m/z303，负离子模式下则按相同裂解方式得到m/z301，结合文献[10]可推断该峰对应化合物为rutin。

2.3.6生物碱类

(1)原小檗碱型生物碱峰14、15、16对应物质均为原小檗碱型生物碱，检测到的母离子峰为[M]+峰，裂解途径主要以取代基的碎裂为主。峰14的分子离子[M]+为m/z338，脱去两分子甲基生成离子m/z308，结合文献[11-12]可推断为jatrorrhizine。峰15、16的分子离子[M]+为m/z336和m/z352，峰23的碎片离子有m/z321[M-CH3]+、m/z306[M-2CH3]+及m/z278[M-2CH3-CO]+，峰24的碎片离子有m/z336[M-CH3-H]+、m/z321[M-2CH3-H]+等。比较文献可初步推断峰15、16为berberine和palmatin。

(2)四氢原小檗碱型生物碱峰13准分子离子峰为[M+H]+峰为m/z356，其进一步裂解可得到碎片离子m/z192，这是明显发生了RDA裂解后生成的含氮碎片离子，可推断峰13为tetrahydropalmatine。峰7分子离子[M]+为m/z342，同时也存在m/z192这一RDA裂解的特征离子，以及进一步脱去一分子CH3的m/z177和CHO的m/z148，可推断为phellodendrine。

(3)阿朴啡型生物碱峰8、9、11在m/z160～220间没有RDA裂解形成的高丰度碎片离子，碎片离子主要集中在m/z290～350的高端质谱区。峰8分子离子[M]+为m/z342，脱去一分子CH2O生成m/z312，进一步碎裂得到m/z282[M-(CH3)2NH-CH3]+和m/z265[M-(CH3)2NH-CH3OH]+，根据相关文献推断峰8为magnoflorine。峰9分子离子为m/z314，同时得到碎片离子m/z269[M-(CH3)2NH]+，可推断峰9为oblongine。峰11的分子离子[M]+为m/z356，同时得到碎片离子m/z311[M-(CH3)2NH]+，可推断为menisperi。

3　结　论

本实验以现代分析技术LC-MS为依托，对大鼠灌胃大黄硝石汤后尿样中的原形成分进行了鉴别，最终推断出包含蒽醌类、生物碱类、环烯醚萜类为主的共22种原形成分，均为单味药中的主要活性成分之一。此次实验为大黄硝石汤复方的体内代谢研究提供了更多的物质基础，可通过对尿样中代谢物的鉴别对其进行进一步研究。

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Identification of Xenobiotics of Dahuangxiaoshi DecoctioninRatUrinebyLC-TOF/MS

XIE Rui1, FENG Fang1,2

(1 School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Jiangsu Nanjing 210009;2 Key Laboratory of Drug Quality Control and Pharmacovigilance (China Pharmaceutical University),Ministry of Education, Jiangsu Nanjing 210009, China)

Thehighperformanceliquidchromatography-TOF/MS(LC-TOF/MS)wasusedtoidentifythexenobioticsofDahuangxiaoshidecoctioninraturine.ObtainedtheTICinpositive/negativemode, 22xenobioticsweretentativelyidentifiedordeducedaccordingtoreferencesandtheirdatainconnectionwithextractedionschromatographictechnique,whichcouldbeafoundationforfurtherstudyonthemetabolismofDahuangxiaoshiDecoction.

Dauhuangxiaoshidecoction;xenobiotics;highperformanceliquidchromatography-TOF/MS(LC-TOF/MS)

谢瑞(1991-)，男，中国药科大学硕士，药物分析方向。

冯芳，中国药科大学教授，博士生导师，方向药物质量研究与评价。

R927.1

A

1001-9677(2016)013-0118-04