草苁蓉提取物特征图谱研究*

王 松 容艳芬 陈智国* 邹志涛

（湖北省食品药品监督管理局技术审评核查中心·武汉 430071）

草苁蓉提取物特征图谱研究*

王 松 容艳芬**陈智国***邹志涛****

（湖北省食品药品监督管理局技术审评核查中心·武汉 430071）

目的:建立草苁蓉提取物的特征图谱。方法：采用高效液相色谱法以Agilent C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱，乙腈-水梯度洗脱，流速：0～60min 0.5mL·min-1，60～110min 0.8mL·min-1，检测波长260nm，柱温30℃。结果:10批草苁蓉提取物特征图谱相似度较高, 利用“中药色谱特征图谱相似度评价软件”生成了草苁蓉提取物的对照特征图谱,共有19个特征峰。结论:采用HPLC特征图谱技术可以有效地对草苁蓉提取物进行质量评价。

草苁蓉提取物 特征图谱 高效液相色谱法

草苁蓉(Boschniakia rossica Fedtsch et Flerov)系列当科草苁蓉属(Boschniakia)植物，俗名不老草[1-2]。主要分布于中国长白山地区、日本富士山及朝鲜北部山区等。草苁蓉具有补肾壮阳、润肠止血、滋补强身及延年益寿的功效，用于治疗肾虚阳痿、腰膝冷痛、习惯性便秘、膀胱炎、功能性子宫出血、肾炎等疾病[3-4]。草苁蓉为东北传统道地药材，其化学成分复杂，经醇提后的草苁蓉提取物具有保肝、抗脂质过氧化的活性等药理作用[5]。目前，关于草苁蓉提取物有效成分尚不明确,对于草苁蓉提取物的质量控制研究还未见报道，本实验拟利用HPLC法对草苁蓉醇提物进行分析，建立草苁蓉提取物的特征图谱，从整体成分控制本品的质量。

1 仪器与材料

DIONEX高效液相色谱仪(DIONEX UV3000液相色谱系统)；草苁蓉(产地:长白山)，经湖北中医药大学张秀桥教授鉴定为列当科植物草苁蓉(Boschniakia rossicaFedtsch et Flerov)的干燥全草;草苁蓉提取物:取草苁蓉干燥后的全草，粉碎成粗粉，用90%乙醇做溶剂，提取3次，每次1h，合并滤液，减压浓缩，干燥，研成细粉，加适量辅料，混合均匀，即得。乙腈(TEDIA)为色谱纯、水为超纯水，其它试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备。精密称取草苁蓉提取物5g，加50%乙醇100ml,称定重量，浸泡过夜。再称定重量，用乙醇补足减失的重量。过滤，滤液挥干，加水10ml溶解，用氯仿萃取水液(3次，每次10ml),合并氯仿层，挥干，加甲醇10ml，定容。用0.45µm微孔滤膜滤过，即得。

2.2 检查方法。高效液相色谱法[6-10]

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18(4.6×250mm,5µm)；流动相：乙腈-水为流动相，梯度洗脱。柱温30℃；检测波长：260nm；进样10µl，洗脱梯度变化条件：0～60min（10:90），流速：0.5mL·min-1，60～110min（30:70），流速：0.8mL•min-1。

2.2.2 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样5次，记录各共有色谱峰保留时间和峰面积，共有峰相对保留时间的RSD在1.3%～1.9%之间，相对峰面积的RSD值在1.54%～2.29%之间，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》中关于药材部分的要求，表明仪器精密度良好。

2.2.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0，2，4，8，12h进样，记录特征图谱。结果表明，19个主要色谱峰相对保留时间无明显变化，RSD小于2.0%，各共有峰面积比值RSD小于3.0%，结果说明检测方法与供试品稳定。符合特征图谱研究的技术要求。

2.2.4 重现性试验 取同一批供试品5份，按供试品溶液制备方法制备，进行检测，各色谱峰的相对保留时间的RSD在1.24%～1.72%之间，相对峰面积的RSD在1.62%～2.25%之间，符合指纹图谱的技术要求，说明本方法具有较好的重现性。

2.3 特征图谱的建立

2.3.1 共有特征峰的标定 分别检测10批草苁蓉提取物的HPLC特征图谱，10批草苁蓉提取物的特征图谱数据见表1、2。在上述色谱条件下，供试品在80min内大约出峰24个，其中19个色谱峰是各批供试品所共有。共有峰总面积占总峰面积的93%，各个供试品特征峰的峰形及相对保留时间较为一致，10批草苁蓉提取物的色谱中，共有特征峰重叠率为90%以上。据此确定为草苁蓉提取物的主要特征峰。

2.3.2 草苁蓉提取物的对照特征图谱 根据各供试品的色谱参数，将各供试品均含有的特征成分14号峰作为参照峰(S峰)，确定各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值等技术参数。19个共有特征峰(相对保留时间)和共有特征峰面积比值,见表1和表2。据此确定为草苁蓉提取物的对照特征图谱。

表1 10批草苁蓉提取物共有特征峰的相对保留时间(n=10）

表1 10批草苁蓉提取物共有特征峰的相对峰面积

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2.3.3 相似度评价 分别以对照特征图谱为参照,利用“中药色谱特征图谱相似度评价系统A 版”软件采用夹角余弦法计算10批草苁蓉提取物供试品的相似度，相似度在0.93～0.98。结果表明对草苁蓉提取物具有质量控制意义。

3 讨论

（1）参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》，采用高效液相色谱法建立了草苁蓉提取物的特征指纹图谱，共标定了19个共有指纹峰，方法可靠、重现性、稳定性良好。

（2）图谱中3号峰峰面积最大，但其出峰频次为9次，且峰型较差，理论塔板数没有14号峰高。3号峰相对保留时间和相对峰面积的RSD%值都较高，其精密度没有14号峰高，最后我们选择峰面积其次的14号峰作为S峰。

（3）试验过程中比较了238、254、260、275、283、290nm等处检测波长，结果表明，检测波长为260nm波长时色谱峰较多且峰形较好，综合考虑，选定260nm为特征图谱检测波长。

[1] 马毓泉.内蒙植物志(第5卷)[M].呼和浩特:内蒙古人民出版社,1980.

[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志 (第69卷) [M].北京:科学出版社, 1999.

[3] 李彩峰,王晓琴,刘勇,肖培根.草苁蓉化学成分及药理活性研究进展[J].中草药,2014, 45 (7):1016-1023.

[4] 国家中医药管理局.中华本草(第20卷)) [M].上海:上海科学技术出版社, 1999.

[5] 马茜茜,元海丹,叶利,朴光春.不同草苁蓉提取物中化学成分及药理作用的研究进展[J].安徽农业科学,2015,43（7）:11-14.

[6] 谢洁娜,赵明波,吴凤薇,屠鹏飞.荒漠肉苁蓉的HPLC指纹图谱研究[J].中草药,2005,36(2): 268-271.

[7] 杨建华,堵年生,热娜•卡斯木,胡君萍.HPLC测定肉苁蓉中8-表马钱子苷酸的含量[J].药物分析杂志,2006,26(10):1395-1397.

[8] 卢永昌,林鹏程,林生秀.高效液相色谱法测定肉苁蓉中麦角甾苷的含量[J].西南民族大学学报,2006,32 (4):709-711.

[9] 龚立冬,曹玉华,侯建霞.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定肉苁蓉中的甜菜碱[J].色谱,2007,25(2):280-281.

[10] 张英,鞠爱华,周秀娟,张慧文.草苁蓉药材高效液相指纹图谱研究[J].中国药业,2013,22(16):30-32.

（2017-03-13 收稿）

* 国家中医药管理局中医药行业科研专项基金（201007012）。

** 通讯作者

*** 湖北中医药大学·武汉 430065

**** 三峡大学中医临床医学院宜昌市中医医院·湖北 443003