气相色谱-质谱法测定水产加工制品中酚类抗氧化剂残留*

余　颖

(福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)



气相色谱-质谱法测定水产加工制品中酚类抗氧化剂残留*

余颖

(福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)

本文建立了一种固相萃取-气相色谱-质谱检测法，用于检测水产加工制品中5种酚类抗氧化剂残留。5种酚类抗氧化剂为二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、特丁基对苯二酚(TBHQ)、4-己基间苯二酚(4-HR)和没食子酸丙酯(PG)。研究过程如下：用乙酸乙酯提取样品，硅胶柱净化，正己烷、乙酸乙酯洗脱，气相色谱-质谱测定，外标法定量。研究显示：在质量浓度为0.05 ～10μg/mL范围内，抗氧化剂的响应值与质量浓度的线性关系良好，相关系数为0.9971～0.9998。在0.05～1mg/kg添加浓度下，丁香鱼干、虾干和干贝加标样品的日内和日间平均回收率为70.6%～119%，相对标准偏差为1.09%～9.80%；BHT、BHA、TBHQ和4-HR的检出限为0.01mg/kg，最低定量限为0.05mg/kg；PG的检出限为0.05mg/kg，最低定量限为 0.25mg/kg。研究结果表明，本文建立的固相萃取-气相色谱-质谱检测法可以有效的检测出水产加工制品中的5种酚类抗氧化剂残留。

酚类抗氧化剂； 气相色谱-质谱法； 水产加工制品； 残留

引用格式：余颖. 气相色谱-质谱法测定水产加工制品中酚类抗氧化剂残留[J].中国海洋大学学报(自然科学版)， 2016, 46(8)： 64-71.

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抗氧化剂是指能防止食品成分因氧化而导致变质的一类食品添加剂，主要用于防止油脂及富脂食品的氧化酸败，以及由氧化所导致的褪色褐变以及维生素被破坏等[1]。丁基羟基茴香醚(Butylatedhydroxylanisole，BHA)、特丁基对苯二酚(Tert-butylhydroquinone，TBHQ)、二丁基羟基甲苯(Butylatedhydroxyltoluene，BHT)、没食子酸丙酯(Propylgallate，PG)和4-己基间苯二酚(4-hexylresorcinol，4-HR)属于食品中常用的酚类抗氧剂。中国《食品添加剂使用标准》(GB2760-2011)中规定：BHA、TBHQ、BHT、PG在风干、烘干、压干等水产品中最大使用量为0.1～0.2g/kg；4-HR在虾类中使用后残留量应≤1mg/kg[2]。2010年7月，美国麦当劳麦乐鸡被报道含有从石油中提炼的抗氧化剂特丁基对苯二酚，引发消费者的强烈关注[3]。生产商们常常添加几种不同抗氧化剂以提高抗氧化效果，有可能使其残留量超过《食品添加剂使用标准》中的规定，从而对人体产生一定危害[4]。

目前，抗氧化剂检测的现行标准主要有以下几个：美国国家标准学会的现行标准AOAC983.15-1994 规定了用液相色谱法测定油、脂肪和乳脂肪中的酚类抗氧化剂[5]；中国现行的标准中SN/T1050-2002规定了进出口油脂中9种抗氧化剂的高效液相色谱测定方法[6]；GB/T23373-2009规定了用气相色谱法测定食品中抗氧化剂BHA、BHT与TBHQ的方法[7]。国内外常用的酚类抗氧化剂检测方法主要有以下几类：①液相色谱法，主要有高效液相色谱法[8-10]、凝胶渗透色谱-固相萃取-高效液相色谱法[11]、反相高效液相色谱法[12]等；②气相色谱法[13-17]；③气相色谱-质谱联用法，如离子阱质谱法[18]、凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱法[19]、单四级杆质谱法[20]、全二维气相色谱-飞行时间质谱法[21]等；④液相色谱-质谱联用法，如超高效液相色谱-串联质谱法[22]、固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法[23]、液相色谱-飞行时间质谱法[24]等；⑤其它方法，如毛细管电泳法[25]及毛细管胶束电动色谱法[26]等。抗氧化剂残留检测方法研究已在油脂、饲料、油炸食品和方便食品等中广泛开展，但以动物源食品为基质的研究鲜有报道，水产加工制品中酚类抗氧化剂多组分残留的检测方法研究尚处空白。本研究采用气相色谱-质谱联用法进行检测，建立了水产加工制品中5种酚类抗氧化剂残留量的检测方法。气相色谱-质谱联用法采用保留时间及定性离子相结合的方式进行定性，克服了液相色谱法及气相色谱法定性不够准确的缺点且灵敏度高，能够满足水产加工制品中酚类抗氧化剂残留量检测的需求，为水产行业对酚类抗氧化剂的监管及相关标准的制定提供技术支持。

1　材料与方法

1.1 主要仪器与试剂[27]

气相色谱-质谱联用仪(美国Thermo公司，TraceDSQ)；旋涡振荡器(德国IKA公司，MS3)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ-250DE)；离心机(北京时代北利离心机有限公司，LD4-8)；固相萃取装置(美国Alltech公司)；氮吹仪(天津恒奥科技发展有限公司，HGC-24)；旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司，R205)。

正己烷、乙酸乙酯为色谱纯；氯化钠、无水硫酸钠(650℃灼烧4h，冷却后贮于密闭容器中备用)为分析纯；硅胶柱(CNW，2000mg/6mL)。

标准物质丁基羟基茴香醚(BHA)、特丁基对苯二酚(TBHQ)、二丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)和4-己基间苯二酚(4-HR)购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，分别用乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液配制成100μg/mL的标准溶液，储存于4℃冰箱中，使用时再用乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液配制成所需浓度的混合标准工作液。

1.2 样品前处理方法

1.2.1 样品预处理丁香鱼干、虾干、干贝取可食部分，剪成不大于0.25cm×0.25cm×0.25cm的小块后混匀，置于-18℃以下冷冻保存备用。

1.2.2 提取[27]称取5g样品(精确至0.01g)置于50mL离心管中，加入15mL乙酸乙酯，旋涡振荡30s，超声提取10min。3500r/min离心5min，移取上清液于100mL离心管中。再加入10mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上清液于100mL离心管中。在提取出的上清液中加入10mL饱和氯化钠溶液，旋涡振荡30s，3500r/min离心5min，移取上清液过无水硫酸钠于100mL鸡心瓶中，40℃旋转蒸发至近干。用1mL乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液溶解鸡心瓶中的残留物，待净化。

1.2.3 净化硅胶柱用5mL正己烷活化，样液过柱，分别用8mL正己烷、5mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液。将洗脱液于40℃氮吹至近干，用乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液定容至1mL，供气相色谱-质谱分析。

1.3 分析条件[27]

1.3.1 色谱条件色谱柱：TG-17MS(30m×0.25mm×0.25μm)；升温程序：起始温度100℃，保持1min，以 20℃/min升到270℃保持7min；进样口温度：280℃，进样方式：不分流进样，进样体积为1μL；载气：高纯氦气(纯度≥99.999%)，流速1.0mL/min。

1.3.2 质谱条件离子源：EI源；电子能量：70eV；离子源温度：250℃；传输线温度：280℃；溶剂延迟：3min；采集方式：选择离子监测(SIM)模式；质量扫描范围：50～400amu。各目标物的保留时间及特征离子见表1。

表1　5种抗氧化剂的保留时间及特征离子

2　结果与讨论

2.1 气相色谱分析条件优化

已报道的抗氧化剂的气相色谱分析方法中，色谱柱通常采用弱极性的DB-5MS[18]和中等极性的DB-1701[7]或DB-17[28]。本研究中测定的5种抗氧化剂的极性为中等到较强，比较了TG-5MS和TG-17MS这2种色谱柱对5种抗氧化剂的响应值及分离效果。结果表明，BHT与BHA在TG-5MS色谱柱上的保留时间非常接近，很难达到完全的基线分离，且PG的响应值较低，会产生拖尾峰。但采用TG-17MS色谱柱，通过优化色谱升温程序，可获得峰型尖锐对称的目标峰，实现完全的基线分离，且响应值高，有利于准确地定性与定量。色谱柱升温速率对目标物的分离也有较大影响，升温速率过快，目标物的保留时间太接近，不利于分离；而升温速率过慢则影响峰形及延长分析时间。进样口温度的选择对目标物的响应值有较大影响，合适的进样口温度既能保证样品全部组分完全汽化，又不引起样品分解。因此，本研究确定进样口温度为280℃，可获得最佳响应值。按1.3已优化的分析条件，5种抗氧化剂混合标准溶液(浓度为0.25μg/mL)的总离子流图见图1。

图1　抗氧化剂标准溶液(0.25μg/mL)总离子流图

2.2 样品前处理方法的研究

2.2.1 提取溶剂的选择及提取次数的优化水产品中蛋白、色素含量较高，因此应选择对目标物溶解性好且对蛋白等杂质溶出尽可能小的溶剂，以降低后续样品净化的难度。已报道的研究常采用乙酸乙酯[17]、乙腈[9,12,14]、乙醚[18,20]等作为提取溶剂。本研究比较了乙酸乙酯、乙腈、甲醇和乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液对5种抗氧化剂的提取效果，结果见图2。甲醇对目标物的提取率较低，杂质峰较多，基线噪音大，不利于样品的检测分析。其余3种溶剂的提取效果均较好，但在提取液浓缩的过程中，乙腈浓缩的速度较慢且毒性较大，不利于大批量样品的快速检测,且乙腈虽然对BHT和BHA的提取率较高，但对TBHQ的提取率较低，这与曹淑瑞等[19]的研究结果一致。乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液溶出较多色素，会加大后续净化的难度。因此选择乙酸乙酯为提取溶剂。实验还考察了提取次数对目标物回收率的影响，分别比较了提取1次、2次和3次的效果，结果表明，提取2次可将目标物基本提取完全，再增加提取次数，目标物的回收率基本没有变化。

图2　不同溶剂提取效果比较

2.2.2 净化方法

2.2.2.1 液-液萃取水产品基质的复杂性会对抗氧化剂的定性定量分析造成干扰，且会污染色谱柱及离子源。乙酸乙酯提取液虽然杂质峰较少，但仍含有少量蛋白、色素等脂溶性杂质，因此有必要进行有效净化。已报道的抗氧化剂提取液的净化多采用液-液萃取[9,18]、固相萃取[11,23]以及两者相结合的方式[22]。本研究采用饱和氯化钠溶液对乙酸乙酯提取液进行液-液萃取，实验证明饱和氯化钠溶液形成的水相可溶解大多数糖类及蛋白质，从而达到去除极性较强的水溶性杂质，提高提取回收率的目的。

2.2.2.2 固相萃取柱的选择液-液萃取方式可有效减少水溶性杂质的干扰，但对于基质复杂的水产品净化效果仍不够理想，脂肪、色素基质很难净化完全。因此可采用固相萃取法进一步去除杂质。固相萃取的主要优势在于对复杂样品基质的净化效果较好，可对极低浓度的组分进行富集，并能减少质谱应用中的离子抑制或离子增强现象，适用于水产品中痕量残留的检测。

实验分别比较了相同规格(2000mg/6mL)的硅胶柱、弗罗里硅土柱、C18柱和HLB柱的净化效果，结果见图3。在4种固相萃取柱中，硅胶柱对目标物各组分(添加浓度为1mg/kg)的回收率最高，且能有效去除杂质，使杂质峰与目标峰完全分离。因此实验采用硅胶柱为净化柱能满足检测分析要求。

图3　不同固相萃取柱的净化效果比较

2.2.2.3 洗脱液的选择及洗脱体积的优化本研究比较了乙酸乙酯和乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液对5种抗氧化剂的洗脱效果。结果表明，乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液对BHT和BHA的洗脱效果较差，而乙酸乙酯对BHT的洗脱效果较差。考虑到这5种酚类抗氧化剂的极性有一定差异，实验考察了选用2种极性不同的洗脱液即正己烷和乙酸乙酯分别洗脱这5种目标物。实验证明，正己烷和乙酸乙酯这2种洗脱液分别洗脱可达到最好的效果。同样，因为5种目标物的极性相差较大，难以用上样、淋洗、洗脱的步骤同时净化所有的目标物，因此本研究采用上样、洗脱的步骤，使杂质保留在固相萃取柱上，而直接洗脱目标物以达到净化目的。为了能将目标物从硅胶柱上完全洗脱下来，对洗脱液体积进行优化实验。将5g空白样品按1.2.2法提取，提取液加入5种抗氧化剂混合标准溶液(添加浓度为1mg/kg)，浓缩液过硅胶柱，分别用正己烷和乙酸乙酯洗脱，收集不同体积的洗脱液，测定各目标物的回收率。结果表明，在正己烷洗脱体积为8mL、乙酸乙酯洗脱体积为5mL时，目标物各组分可完全被洗脱。

按优化后的样品前处理方法所得的丁香鱼干、虾干及干贝的空白样品和加标样品(添加浓度为BHT、BHA、TBHQ和4-HR0.05mg/kg，PG0.25mg/kg)总离子流图见图4～图6。结果表明，该方法前处理过程简单易操作，有机试剂用量少，样品净化效果理想，目标峰附近无杂质峰干扰。采用液-液萃取和固相萃取相结合的净化方式可有效地消除基质效应，避免色谱柱和离子源的污染，提高了方法灵敏度及结果的准确性，且提取回收率高。

图4　丁香鱼干空白样品(a)和加标样品(b)总离子流图

图5　虾干空白样品(a)和加标样品(b)总离子流图

图6　干贝空白样品(a)和加标样品(b)总离子流图

2.3 方法有效性的评价

2.3.1 线性范围、检出限和最低定量限将5种抗氧化剂标准储备液用乙酸乙酯-正己烷(1∶1，v/v)溶液配制成质量浓度分别为0.05、0.1、0.5、2、5、10μg/mL的系列标准混合溶液，进行气相色谱-质谱分析，外标法定量。以标准溶液质量浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制标准曲线，计算相关系数。方法检出限是以信噪比≥3估算，BHT、BHA、TBHQ和4-HR的检出限均为0.01mg/kg，PG的检出限为0.05mg/kg。最低定量限是以样品加标回收率在70%～120%之间，信噪比≥10，相对标准偏差≤15%时所对应的浓度值表示。实验中抗氧化剂各组分加标浓度为BHT、BHA、TBHQ和4-HR0.05mg/kg，PG0.25mg/kg时，平均回收率为75.9%～90.6%，相对标准偏差为5.44%～8.79%，且信噪比大于10。因此，本方法确定BHT、BHA、TBHQ和4-HR的最低定量限为0.05mg/kg，PG的最低定量限为0.25mg/kg。各组分的线性回归方程、相关系数、检出限和最低定量限见表2，在0.05～10μg/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9971～0.9998。

表2　5种抗氧化剂的线性回归方程、相关系数、检出限和最低定量限

2.3.2 方法的准确度和精密度按1.2所述方法，分别在丁香鱼干、虾干和干贝空白样品中添加不同浓度的抗氧化剂混合标准溶液进行加标回收试验，添加浓度分别为0.05、0.5、1mg/kg，每个浓度水平重复6次。为了验证方法的再现性，又进行了这3个浓度水平的日间加标回收试验。结果分别见表3和4，日内平均回收率为76.9%～119%，相对标准偏差为1.67%～9.78%；日间平均回收率为70.6%～113%，相对标准偏差为1.09%～9.80%，均符合药残检测技术要求。

表3　加标样日内平均回收率和相对标准偏差，n=6)

表4　加标样日间平均回收率和相对标准偏差，n=6)

3　结语

本研究建立了水产加工制品中5种酚类抗氧化剂BHT、BHA、TBHQ、4-HR和PG残留的气相色谱-质谱检测方法。样品采用乙酸乙酯提取，液-液萃取和硅胶柱固相萃取净化，有效地去除样品中蛋白、色素等杂质，前处理过程简单，样品检测周期短，试剂用量少且毒性小，净化效果好，运行成本较低，适合批量样品的检测。优化了色谱分析条件，提高仪器对目标物的响应，建立的分析方法灵敏度和稳定性较好，准确度和精密度均符合药残检测技术要求，可应用于水产加工制品中酚类抗氧化剂残留的日常检测。

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责任编辑朱宝象

DeterminationofPhenolAntioxidantsResidueinProcessedAquaticProductsbyGasChromatography-MassSpectrometry

YUYing

(TheKeyLaboratoryofCultivationandHigh-ValueUtilizationofMarineOrganismsinFujianProvince,FisheriesResearchInstituteofFujianProvince,Xiamen361013,China)

Antioxidantisakindoffoodadditive,whichcanpreventfoodingredientsduetooxidationandleadtodeterioration.Itismainlyusedtopreventingoxidativerancidityoffatsandfatrichfood,aswellasoxidationcausedbyfadingbrowninganddestructionofvitaminamongothers.Theresearchonthedetectionmethodofantioxidantshasbeenwidelycarriedoutintheoil,feed,friedfoodandconveniencefood,buttheresearchontheanimalsourcefoodisscarce.Researchonthedetectionmethodofphenolicantioxidantsinaquaticproductsisstillblank.Gaschromatography-massspectrometry(GC-MS)coupledwithsolid-phaseextractionwasdevelopedfordeterminingfivephenolantioxidantsresidueinprocessedaquaticproductsincludingbutylatedhydroxylanisole(BHA),tert-butylhydroquinone(TBHQ),butylatedhydroxyltoluene(BHT),propylgallate(PG)and4-hexylresorcinol(4-HR).Theeffectsofdifferentextractingagents,extractiontimes,solid-phaseextractioncolumns,elutionsolutionsandelutionvolumeontheextractionwereinvestigated.Thephenolantioxidantswereextractedwithethylacetate,purifiedbysilicagelcolumnandelutedwithn-hexaneandethylacetate,thenquantifiedwithGC-MSbyreferringtotheexternalstandards.Withtheoptimizedmethod,recoverytestsweredonebyaddingantioxidantmixedstan-dardsolutionatdifferentconcentrationstodriedanchovy,shrimpandscallopblanksamplesofintra-dayandinter-day.Thelinearrangewas0.05～10μg/mLandthecorrelationcoefficientwas0.9971～0.9998.Whenspikedwithin0.05～1mg/kg,theaveragerecoveryofintra-dayandinter-daywas70.6%～119%,andtherelativestandarddeviationwas1.09%～9.80%.ThelimitofdetectionandquantitationofBHT、BHA、TBHQand4-HRwas0.01mg/kgand0.05mg/kg,respectively.ThelimitofdetectionandquantitationofPGwas0.05mg/kgand0.25mg/kg,respectively.Thismethodissimple;thesamplehasashortdetectionperiod,thereagentdosageislittle,thetoxicityissmall,thepurificationeffectisgood,andtheoperationcostislow.Suchmethodissuitableforthedetectionofthebatchsample.ThecombinationofretentiontimeandqualitativeionwasusedbyGC-MStoovercometheshortcomingsofhighaccuracyandsensitivityofliquidchromatographyandgaschromatographysothatthemethodshouldmeettherequirementsofthedetectionofphenolicantioxidantsinaquaticproducts.Themethodoptimizedthechromatographicanalysiscondition,improvedthetarget'sresponseoftheinstrument.Thesensitivityandstability,accuracyandprecisionofthemethodareinlinewiththerequirementsofdrugresiduesdetectiontechnology.Thismethodcanbeappliedtothedeterminationoffivephenolantioxidantsresiduesinprocessedaquaticproducts.

phenolantioxidant;chromatography-massspectrometry;processedaquaticproducts;residue

福建省省属公益类科研院所基本科研专项(2013R001-6)；福建省海洋高新产业发展专项(闽海洋高新[2014]18号)资助

2015-04-01；

2015-12-16

余颖(1981-)，女，工程师，从事水产品质量安全及渔业环境监测研究工作。E-mail:yuying504@163.com

O657

A

1672-5174(2016)08-064-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20150118

SupportedbytheProvincialPublicResearchInstituteofFujianAcademyofFundamentalResearch(2013R001-6);TheDevelopmentofSpecialMarinehigh-techIndustryinFujianProvince(FujianMarineHigh-tech[2014]18)