久效磷对斑马鱼胚胎期心脏和骨骼发育的毒性效应研究*

岳　东， 张晓雪， 赵　飞， 汝少国

(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)



久效磷对斑马鱼胚胎期心脏和骨骼发育的毒性效应研究*

岳东， 张晓雪， 赵飞， 汝少国**

(中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003)

有机磷农药具有一定的胚胎发育毒性，以往有机磷农药胚胎发育毒性的研究主要集中于个体水平。本研究以斑马鱼(Danio rerio)作为受试生物，采用0.000 4、0.004、0.04和0.4mg/L的久效磷自受精卵暴露斑马鱼胚胎至受精后96h(96hpf)。研究结果表明,久效磷对胚胎的存活率、孵化率均无显著影响，但显著降低了36hpf胚胎的心率，96hpf仔鱼心包囊肿率和脊柱弯曲率显著升高；久效磷暴露胚胎至48hpf显著降低了心脏发育相关基因(Tbx2)的表达水平、显著升高了肌肉发育相关基因(Mef2c)的表达水平。可见，久效磷能够在个体和分子水平上影响斑马鱼胚胎心脏和骨骼的发育，对斑马鱼胚胎心脏和骨骼的发育具有毒性效应。

久效磷；斑马鱼；发育毒性；心脏；骨骼

引用格式：岳东， 张晓雪， 赵飞， 等. 久效磷对斑马鱼胚胎期心脏和骨骼发育的毒性效应研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2016, 46(8): 72-78.

YUEDong,ZHANGXiao-Xue,ZHAOFei,etal.StudyofthetoxicityofmonocrotophosonthecardiacandskeletaldevelopmentofDanio rerioembryos[J].PeriodicalofOceanUniversityofChina, 2016, 46(8): 72-78.

有机磷农药作为有机氯类杀虫剂替代品在农业生产中大量使用，但在使用过程中会随雨水冲刷等途径进入河流、湖泊和海洋，造成水体污染，对水生生物构成威胁。有机磷农药久效磷(MCP)曾广泛应用于农业生产，但其大量使用也产生了很多环境问题，据报道久效磷与阿根廷斯温氏鹰(Buteo swainsoni)的死亡有关[1]，另有报道显示久效磷对鸟类、蜜蜂等具有极高毒性，对鱼类等具有中毒[2]。由于危害严重，已在很多国家禁止使用，在国际农药行动网的高危害农药列表(2010)中，久效磷被要求全球淘汰。中国自2007年1月1日起全面禁止生产、经营和使用，但仍能检测到其残留，如在中国某水源地久效磷含量为0.165μg/L[3]，2010年武汉市农产品质量安全监督检测站发现产自西部某市的荷兰豆样品中含有久效磷农药[4]；在印度雨水和巴基斯坦四大棉花密集种植区的浅层地下水中检测到的久效磷残留浓度分别高达4和8.3μg/L[5-6]。久效磷农药具有胚胎毒性，能够导致牙鲆胚胎孵化率降低[7]和小鼠胚胎死胎率升高[8]，严重影响体外培养小鼠胚胎的发育，导致囊胚期胚胎内细胞团形态发育异常以及细胞数目的减少[9]；吡唑硫磷等能够引起动物胚胎心包囊肿以及骨骼弯曲[10-12]，然而久效磷是否能够引起类似的效应目前还未知。在胚胎发育过程中，关键基因的表达变化会导致心脏、骨骼等发育异常[13-14]。很多基因参与调控脊椎动物胚胎心脏和骨骼的发育过程：T-box家族基因参与调控脊椎动物心脏的发育[15]，其中，心脏发育相关基因Tbx2在心脏形成的早期阶段发挥重要作用[16-17]；肌肉发育相关基因Mef2c是参与调控心肌和骨骼肌发育的关键基因之一[18-20]，以往还未见结合关键基因的表达变化探究有机磷农药对胚胎心脏和骨骼发育毒性潜在机制的研究报道。因此，本文以斑马鱼胚胎为实验对象，在个体和分子水平上探讨了久效磷对斑马鱼胚胎期心脏和骨骼发育的毒性效应及潜在机制。

1　材料与方法

1.1 实验用鱼

将实验室自行培养的12月龄性成熟T系斑马鱼雌雄分开，分别驯养于30L水族箱中，加入连续曝气24h以上的脱氯自来水，驯养条件为：水温(28±1) ℃，溶解氧(7.0±0.1)mg/L，pH=7.6±0.2，光照周期14h∶10h。每天喂食丰年虾(实验室孵化)2次，换水4/5。驯养1个月后，按1∶2比例选择怀卵雌鱼和健康雄鱼捞入自制产卵小室中进行产卵。次日，待亲鱼产卵完毕后收集健康的受精卵用于暴露实验。

1.2 久效磷暴露实验

久效磷(Monocrotophos)纯品购自(Sigma-Aldrich,Shanghai,China)，纯度为99.3%。实验过程中配制浓度为0.1g/L储备液，4 ℃避光保存，每周更新储备液一次。采用2L烧杯盛放1L曝气自来水，久效磷暴露浓度设置为0、0.000 4、0.004、0.04和0.4mg/L，每个浓度设置2个烧杯，每天换水1/2，每个烧杯中放入150枚受精卵，实验条件同驯养条件。

自暴露开始至72hpf，每隔12h清理烧杯内的死卵(胚胎变白，不透明)并统计胚胎的存活率，同时统计48、60、72hpf3个时间节点的胚胎孵化率。存活率(%)=存活胚胎数/总胚胎数×100%，孵化率(%)=已孵化胚胎数/总胚胎数×100%。暴露至48、60hpf，取烧杯中的胚胎或孵化出的仔鱼吸尽水分置于1.5mL离心管中，每25条仔鱼混作一个样品(n=4)，将样品液氮速冻，尔后转移至-80 ℃保存，用于基因表达水平的测定。暴露至96hpf将烧杯中的仔鱼用10%甲醛固定，在显微镜(OlympusCX31,JAPAN)下观察记录仔鱼的畸形情况并进行拍照。计算公式如下：

畸形率(%)=畸形胚胎数/总胚胎数×100%。

斑马鱼心率统计在24孔板中完成，准备5个24孔板，浓度设置与烧杯一致，每个板上设置同一个浓度。每孔加入3mL暴露液并放置2枚受精卵。每天更换一半暴露液，并清除死卵。暴露至36hpf将24孔板置于显微镜(OlympusCX31,JAPAN)下统计胚胎20s内的心跳数。

1.3 基因表达分析

用E.Z.N.A.TMMicroEluteTotalRNAKit(OmegaBio-Tek,USA)进行总RNA抽提。提取所得总RNA用NanoDrop2000c紫外分光光度计(ThermoScientific,USA)测定RNA质量及浓度。等量的总RNA(1μg)通过PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser(TaKaRa,Shiga,Japan)反转录为cDNA，所有操作均严格按照试剂盒说明进行。根据Genbank已发表的序列，采用引物设计软件PrimerPremier5.0software(PREMIERBiosoftInt.PaloAlto,USA)依照qPCR的引物设计原则[21]设计目的基因Tbx2、Mef2c的特异性引物 (见表1)，β-actin(内参)的特异性引物参考Zhang等[22]。用SYBRPremixExTaqTMIIKit(TaKaRa,Shiga,Japan)进行实时定量PCR，采用两步法进行real-timePCR反应，程序设置为：95 °C30s；95 °C5s，60 °C30s，40cycles；为判断引物特异性设置熔解曲线反应，程序设置为：95 °C15s，60 °C60s，95 °C15s，每隔0.5 °C读取一次荧光值。采用参照基因的2-△△Ct法计算目的基因表达量，以β-actin作为内参基因，归一化处理反应体系中的基因扩增，按以下公式：

目的基因相对表达量=log2(2Ct(修正内参基因)-Ct(目的基因)+1)。

表1 Tbx2、Mef2c、β-actin real-time PCR引物序列

1.4 数据分析

各组数据均用平均值±标准差(Mean±SD)表示。应用SPSS(version19.0；SPSSInc.，Chicago，IL)对数据进行统计学分析。首先用Levene’stest对数据进行方差同质性检验，然后采用One-WayANOVA和Tukey’smultiplerangetest检验处理组与对照组之间的统计学差异，0.01

2　结果

2.1 久效磷对斑马鱼胚胎存活率和孵化率的影响

久效磷暴露斑马鱼胚胎至96hpf，各暴露组斑马鱼胚胎的存活率和孵化率与对照组相比均无显著性差异(见图1)。

图1　久效磷对斑马鱼(Danio rerio)胚胎存活率(A)、孵化率(B)的影响

2.2 久效磷对斑马鱼胚胎心率的影响

久效磷暴露斑马鱼胚胎至36hpf，0.000 4、0.004和0.4mg/L暴露组斑马鱼胚胎20s内的心跳数显著减少(P<0.05)，而0.04mg/L暴露组斑马鱼胚胎的心跳数与对照组相比无显著差异(见图2)。

(*P<0.05)

2.3 久效磷对斑马鱼胚胎心脏和脊柱发育的影响

久效磷暴露斑马鱼胚胎至96hpf，各暴露组仔鱼均出现心包囊肿和脊柱弯曲现象，且随着暴露浓度的增加，心包囊肿和脊柱弯曲症状的严重程度增加(见图3、4)。经统计，各暴露组与对照组相比仔鱼心包囊肿率均显著升高(P<0.05)(见图5)；0.000 4mg/L暴露组仔鱼脊柱弯曲率与对照组相比无显著差异，0.004mg/L暴露组仔鱼脊柱弯曲率显著升高(P<0.05)，0.04和0.4mg/L暴露组仔鱼脊柱弯曲率极显著升高(P<0.01)(见图5)。

2.4 久效磷暴露对斑马鱼心脏、肌肉发育相关基因表达的影响

久效磷暴露斑马鱼胚胎至48hpf，0.04和0.4mg/L暴露组Tbx2基因的表达水平极显著降低(P<0.01)，其余暴露组Tbx2基因的表达水平与对照组相比无显著变化；暴露至60hpf，各暴露组Tbx2基因的表达水平与对照组相比均无显著变化(见图6)。

图3　久效磷暴露斑马鱼(Danio rerio)胚胎至96 hpf引起心包囊肿

久效磷暴露斑马鱼胚胎至48hpf，0.4mg/L暴露组Mef2c基因的表达水平显著升高(P<0.05)，其余暴露组Mef2c基因的表达水平与对照组相比无显著变化；久效磷暴露至60hpf，各暴露组Mef2c基因的表达水平与对照组相比均无显著变化(见图6)。

图4　久效磷暴露斑马鱼(Danio rerio)胚胎至96 hpf引起脊柱弯曲

(*P<0.05，**P<0.01)

(*P<0.05，**P<0.01)

3　讨论

存活率、孵化率、心跳、心包囊肿和脊柱弯曲等是斑马鱼胚胎试验中常用的毒理学终点[23-24]。本研究中久效磷暴露对斑马鱼胚胎的存活率和孵化率没有影响，但对斑马鱼胚胎的心脏和骨骼发育产生了毒性效应。研究发现久效磷暴露斑马鱼胚胎至96hpf，仔鱼心脏发育畸形，出现心包囊肿现象，这与之前吡唑硫磷[10]、马拉硫磷、对硫磷[11]暴露导致斑马鱼胚胎产生心包囊肿的结果相似。心包囊肿具有不可逆性，一旦形成就难以自然消失[12]，因此，久效磷暴露斑马鱼胚胎引起的心包囊肿会一直存在于个体发育过程中，能够造成仔鱼心脏的结构异常和功能缺失，甚至威胁到斑马鱼的生存。久效磷除了影响斑马鱼的心脏结构外，还损害了斑马鱼心脏的功能。心率是心脏功能评价最灵敏的指标[25]，研究发现久效磷暴露降低了36hpf胚胎的心率。本研究结果表明久效磷能够在结构和功能上影响斑马鱼胚胎的心脏发育，对斑马鱼胚胎的心脏发育具有明显的毒性作用。

Tbx2基因在心脏形成的早期阶段发挥着至关重要的作用[15]，Tbx2基因能够通过阻碍心室的异常发育和细胞的异常增殖来保证心室的正常收缩，调控心脏的形态发生过程[17]；斑马鱼胚胎Tbx2基因表达受抑制，会导致心包囊肿等形态学异常以及心室发育不良[16]。本研究检测了心脏发育相关基因Tbx2表达量的变化，发现久效磷暴露斑马鱼胚胎至48hpf，0.04和0.4mg/L暴露组Tbx2基因的表达水平极显著降低，相应暴露组斑马鱼仔鱼的心包囊肿率显著上升，说明久效磷可能通过调控Tbx2基因的表达影响心脏的发育，诱发心包囊肿。0.000 4和0.004mg/L暴露组斑马鱼仔鱼出现心包囊肿，而相应暴露组Tbx2基因的表达水平却没有显著变化，可能是由于久效磷对Tbx家族其它基因的影响。斑马鱼中，Tbx2与Tbx3二者之一的异常表达，就能够导致心脏细胞分裂能力的降低[26]，对心脏的发育产生影响。较低浓度久效磷是否主要通过影响Tbx3基因的表达来诱导斑马鱼心脏的发育异常，还有待进一步验证。久效磷暴露斑马鱼胚胎至60hpf，对Tbx2基因表达无明显影响，可能与此时期斑马鱼心脏发育已经完成有关，有研究发现，久效磷对不同发育阶段的斑马鱼GH基因表达的影响是不同的[27]，说明基因对外源物质的敏感性以及应答方式与是否处于该基因的功能时期有关。本研究中，久效磷暴露对48hpf斑马鱼胚胎Tbx2基因的表达具有抑制作用，而对60hpfTbx2基因的表达无明显影响，说明调控心脏发育的Tbx2基因在心脏发育过程中可能对久效磷更为敏感。

吡唑硫磷[10]、马拉硫磷[11]、苯硫磷[12]暴露斑马鱼胚胎能够导致身体弯曲，本研究结果显示久效磷对斑马鱼胚胎的骨骼发育同样具有毒性效应。久效磷暴露斑马鱼胚胎至96hpf，导致仔鱼脊柱弯曲，且随着久效磷暴露浓度的增加，脊柱弯曲的症状加剧。骨骼弯曲会影响鱼类的游泳行为[28]，本实验观察到轻度的脊柱弯曲就能够影响斑马鱼的运动行为，且随着脊柱弯曲程度的加重，斑马鱼的运动能力明显下降，有些严重变形个体因无法游动而停留在烧杯底。本研究结果表明久效磷对斑马鱼胚胎脊柱发育具有致畸效应，并能影响斑马鱼仔鱼的运动行为。

骨骼肌收缩对于骨骼的正常生长具有重要的作用[29]，而骨骼肌的发育异常能够导致骨骼生长异常。肌肉发育相关基因Mef2c是参与调控心肌和骨骼肌发育的关键基因之一[18-20]。本研究通过检测Mef2c基因表达量的变化，从探究久效磷对斑马鱼胚胎骨骼肌发育影响的角度，进一步探究久效磷对斑马鱼胚胎脊柱发育毒性影响的潜在机制。研究中0.4mg/L久效磷暴露斑马鱼胚胎至48hpf显著促进了Mef2c基因的表达，同时发现0.4mg/L久效磷暴露导致斑马鱼仔鱼脊柱弯曲，表明Mef2c基因表达的变化会影响骨骼肌的发育从而导致仔鱼脊柱弯曲。但是其余暴露组也出现仔鱼脊柱弯曲现象，而对应暴露组斑马鱼胚胎的Mef2c基因表达量并未出现显著差异变化，由此推测久效磷暴露可能并不只是通过影响Mef2c基因的表达来影响骨骼肌发育。有研究发现，其他肌肉发育相关基因(如MyoD、Myf5[30-31]等)在骨骼肌发育过程中也发挥着重要作用，因此，可以进一步探究久效磷是否通过改变这些基因的表达水平进而影响骨骼发育。

从研究结果可以看出，在久效磷暴露后，在0.000 4和0.004mg/L处理组斑马鱼仔鱼即出现心包囊肿和脊柱弯曲现象，仔鱼心包囊肿率和脊柱弯曲率与对照比相比也均显著升高；2个处理组的胚胎20s内的心跳数也显著减少。有报道巴基斯坦四大棉花密集种植区的浅层地下水中检测到的久效磷残留浓度高达8.3μg/L[6]，在印度Lucknow市工业废水中检测到的久效磷浓度达到(8.32±3.9)μg/L[32]。由此可见，久效磷的环境浓度已经足够对水生生物的心脏和骨骼发育产生毒性效应，因此，环境中久效磷的污染问题应该引起重视。

综上，本研究发现久效磷暴露斑马鱼胚胎后干扰了心脏发育相关基因Tbx2和肌肉发育相关基因Mef2c的表达，从而导致斑马鱼心脏和骨骼的发育不良，出现心包囊肿和脊柱弯曲现象，从而证明了久效磷对斑马鱼胚胎的心脏和骨骼发育具有致畸效应。

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责任编辑高蓓

StudyoftheToxicityofMonocrotophosontheCardiacandSkeletalDevelopmentofDanio rerioEmbryos

YUEDong,ZHANGXiao-Xue,ZHAOFei,RUShao-Guo

(CollegeofMarineLife,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China)

Monocrotophos(MCP,CASnumber6923-22-4),anorganophosphatepesticide,canadverselyaffectthenormaldevelopmentofmammalembryos,however,itstoxicityontheheartandskeletondevelopmentsoffishembryoshasnotbeenreported.Moreover,previousresearchesontheembryotoxicityoforganophosphoruspesticidesweremainlyperformedattheindividuallevel,withfewstudiescombiningwithmolecularindicatorstofurtherexploretheunderlyingmechanisms.Therefore,usingzebrafishasthemodelanimal,thetoxicityofMCPontheheartandskeletondevelopmentwasinvestigatedatboththeindividualandmolecularlevelsinthisstudy.Embryoswereexposedto0.000 4, 0.004, 0.04and0.4mg/Lmonocrotophosfrom0hpostfertilization(hpf)to96hpf.Theresultsshowedthatcomparedwiththecontrolgroup,therewerenosignificantchangesforthesurvivalandhatchingratesofembryosinalltreatmentgroups.However,pericardialcystwasobservedinlarvaeexposedtoMCPat96hpf,withthefrequenciesofthisdeformitysignificantlyincreasedinalltreatmentgroups.Meanwhile,theheartbeatfrequenciesdecreasedsignificantlyat36hpfinthe0.000 4, 0.04and0.4mg/Ltreatmentgroups.OurdataindicatedamagesonthestructureandfunctionofthezebrafishheartscausedbyMCPexposure.ItisreportedthatabnormalmorphologiessuchaspericardialcystandventriculardysplasiawouldbeinducedwhenTbx2geneexpressionissuppressedinzebrafishembryos.ConsideringthemRNAexpressionsofTbx2decreasedsignificantlyinthe0.04and0.4mg/Ltreatmentgroupsat48hpf,wededucedthathighconcentrationsofMCPmayaffecttheheartdevelopmentthroughinhibitingthegeneexpressionofTbx2,atleastpartly.ThefactthatmRNAexpressionsofTbx2werenotchangedbyMCPat60hpfmaybeexplainedbythecompletionofheartdevelopmentatthistimepoint.Inaddition,theskeletondevelopmentofembryoswasalsoaffectedbyMCP,withthepercentagesofspinalcurvatureincreasedsignificantlyby0.004～0.4mg/LMCPat96hpf.MuscledevelopmentrelatedgeneMef2cisoneofthekeygenesresponsibleforthenormaldevelopmentofskeletalmuscles,whichplaysanimportantroleinbonegrowth.OurresultsfoundthatthemRNAexpressionsofMef2cincreasedsignificantlyinthe0.4mg/Ltreatmentgroupsat48hpf,thusitcouldbespeculatedthatMCPmayimpactthedevelopmentofskeletalmusclebydisturbingthenormalexpressionpatternofMef2c.However,othergeneslikeMyoDandMyf5shouldbefurtherinvestigatedinfuturestudies,asmRNAexpressionsofMef2cexhibitednosignificantchangesinothertreatmentgroups.Inconclusion,thisstudyprovidedbasicinformationonthetoxicityofMCPontheheartandskeletondevelopmentoffishembryosatboththeindividualandmolecularlevels.

Monocrotophos;zebrafish;developmenttoxicity;heart;skeleton

高等学校博士学科点专项科研基金项目(20120132110011)资助

2015-12-22；

2016-03-21

岳东(1989-)，男，硕士，研究方向为生态毒理学。E-mail:ydy214@126.com

**通讯作者：E-mail：rusg@ouc.edu.cn

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A

1672-5174(2016)08-072-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20150410

SupportedbytheResearchFundfortheDoctoralProgramofHigherEducationofChina(20120132110011)