条斑紫菜水通道蛋白PyAQP1基因的克隆及功能分析*

杨俊卿， 孔凡娜， 李　超， 毕桂萁， 孙美娟， 赵海龙， 李　娜， 茅云翔

(1.中国海洋大学海洋生命学院海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛 266003；2.青岛大学附属医院药学部，山东 青岛 266021)



条斑紫菜水通道蛋白PyAQP1基因的克隆及功能分析*

杨俊卿1， 孔凡娜1**， 李超1， 毕桂萁1， 孙美娟2， 赵海龙1， 李娜1， 茅云翔1

(1.中国海洋大学海洋生命学院海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛 266003；2.青岛大学附属医院药学部，山东 青岛 266021)

本研究从条斑紫菜中克隆了一个水通道蛋白(Aquaporin，简称AQP)基因PyAQP，命名为PyAQP1 (登录号为KT735045)。序列分析表明，PyAQP1基因cDNA全长为1 151bp，开放阅读框(ORF)为1 002bp，编码333个氨基酸，含有200bp的内含子。氨基酸序列比对分析表明，PyAQP1具有水通道蛋白的保守结构域NPA和6个跨膜区域。MEGA5.0构建的系统发生树表明，该基因属于Glps类。采用基因枪介导的洋葱瞬时表达定位结果显示，PyAQP1基因定位于细胞质膜上。运用实时荧光定量PCR技术对PyAQP1基因在干旱、盐度和温度处理条件下在转录水平进行分析。在干旱处理条件下，PyAQP1基因随着失水率的增加，表达量逐渐降低，失水率达到80%后复水处理，随着复水时间的延长，表达量增加。在山梨醇和盐度胁迫处理下，PyAQP1基因的表达趋势基本一致，随着盐度的增加，表达量降低。温度处理条件下，在-8 ℃时，基因的表达量显著增加，0 ℃时，基因的表达量略高于正常处理条件。当温度高于正常生长温度时，基因的表达量随着温度的升高，呈现逐渐升高的趋势。本研究为深入了解条斑紫菜逆境适应机制中水通道蛋白的作用奠定了基础，同时为后续条斑紫菜抗逆品系的选育提供了理论指导。

条斑紫菜；水通道蛋白；亚细胞定位；Realtime-PCR；非生物胁迫

引用格式：杨俊卿， 孔凡娜， 李超， 等. 条斑紫菜水通道蛋白PyAQP1基因的克隆及功能分析[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2016, 46(8): 79-86.

YANGJun-Qing,KONGFan-Na,LIChao,etal.CloningandexpressionanalysisofPyAQP1inPyropia yezoensis [J].PeriodicalofOceanUniversityofChina, 2016, 46(8): 79-86.

条斑紫菜(Pyropia yezoensis (Ueda)M.S.HwangetH.G.Choi)隶属于红藻门(Rhodophyta)、原红藻纲(Rhodophyceae)、红毛菜目(Bangiales)、红毛菜科(Bangiaceae)、紫菜属(Pyropia)[1]，是中国北方沿岸常见的种类。条斑紫菜由于其重要的经济价值被大规模栽培，为长江以北的主要栽培藻类之一。在长期的进化过程中，条斑紫菜形成了适应潮间带环境的抗逆基因和生理生化机制，被认为是潮间带藻类研究的模式物种，更是开展抗逆相关分子机理研究的理想材料[2-4]。自然条件下，条斑紫菜的叶状体生活在海水中，能在0～10 ℃的低温下正常生长，-20 ℃冷藏长达数月后，下海仍能复活并正常生长；能忍耐长达2～3d的缺水状态，即使被太阳晒干后发脆，涨潮后仍能正常生活[5]。

干旱、盐度与温度对植物体产生胁迫作用，并导致一系列渗透胁迫、离子胁迫及刺激伤害。各种非生物胁迫都会造成植物体细胞的水分失衡，而水通道蛋白可以有效控制逆境环境下植物体内以及细胞内部水分的运输。水通道蛋白通过影响水分子、小分子物质和部分重金属在植物体内的运输有效地提高植物的抗逆性[6]。

水通道蛋白，又称水孔蛋白，相对分子质量大约在24～34kD[7]。它广泛存在于各种生物膜上，在组织和器官的发育进程以及中性分子的跨膜运输等过程中发挥着重要作用[8]。到目前为止，水通道蛋白已在古生菌、真细菌、真菌、动物和植物等几乎所有的生物中均有发现[9]。在植物中MIP家族(常简称水孔蛋白)，包括7大类，其中常见的有以下4类：质膜内在蛋白(PIPs,Plasmamembraneintrinsicproteins)，液泡膜内在蛋白(TIPs,Tonoplastintrinsicproteins)，类Nod26 膜内在蛋白 (NIPs,Nodulin26-likeintrinsicproteins)与小分子碱性膜内在蛋白(SIPs,Smallandbasicintrinsicproteins)[10]，另外3类分别是GlpF(Glycerolfacilitator) 膜 内 在 蛋 白(存在于低等生物细菌、藻类与苔藓类中)[11]，混合内在蛋白(HIP)和未被分类的XIP内在蛋白[12]。植物水通道蛋白已经被证实在维持体内水平衡和响应盐度、干旱胁迫有重要作用，此外，有些亚类除了运输水分子外，还能够运输氨、硅、二氧化碳和硼等[10,13]。Marinela等人首次从莱茵衣藻中克隆了MIP基因(命名为CrMIP)，并对该基因进行了进化分析，发现该基因与其他物种的MIP同源性较低。通过酵母突变体功能互补实验与同位素14C标记甘油实验，证明该基因能够促进细胞对甘油的摄取[14]。Anderberg等人从已经测序完成的9种绿藻基因组中获得了22条MIPs基因，将22条MIPs基因分为7亚类：MIPA、MIPB、MIPC、MIPD、MIPE、PIPs和GlpF-like。认为MIPA到MIPE5类基因与其他物种中的差异较大，PIP、GlpF-like类与陆地植物中的PIP、GlpF-like类基因相似。推测陆地植物中的PIP、GlpF-like类基因与藻类中的PIP、GlpF-like具有相同的起源[15]。但是，目前关于水通道蛋白在海洋藻类中的功能研究较少，在红藻中尚未发现有关的报道。因此本研究希望能够为海洋藻类的逆境胁迫机制提供依据。

1　材料和方法

1.1 材料

实验材料为实验室培养的条斑紫菜叶状体RZ品系，该品系是通过单细胞酶解后培养所得。亚细胞定位所用洋葱(Allium cepa)为“紫星”品种。

1.2 方法

1.2.1 材料培养与干旱、盐度、温度胁迫处理以新鲜的条斑紫菜叶状体RZ为材料，待叶状体生长长度为10cm左右时，选取叶片完整光滑、色深有光泽且处于旺盛生长期的健康藻体于同一通气瓶中驯化培养。培养条件：盐度为33的过滤海水加PES[16]营养盐，10 ℃，50μmolphotons·m-2·s1，12L∶12D，通气处理。取其中少部分材料进行DNA的提取，部分材料进行干旱、盐度和温度的处理。不同的处理条件见表1(每个处理设置3个平行)。失水率计算公式为：失水率(%)=(鲜重-失水后藻体重)/(鲜重-干重)×100。将处理完的材料迅速收集置于液氮中保存。

1.2.2 条斑紫菜叶状体总RNA的提取、cDNA的合成利用E.Z.N.A.totalRNAKitⅠ(OMEGA)试剂盒提取不同处理条件下RZ叶状体的总RNA，经DNaseⅠ消化后，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，然后用NaNoDrop检测浓度与质量，将A260/A230=2.0～2.2,A260/A280=1.8～2.0的RNA放-80℃保存备用。cDNA的合成采用RocheTranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit。DNA的提取使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)。具体实验步骤参照说明书进行。

1.2.3 PyAQP1基因克隆与生物信息学分析根据实验室已有条斑紫菜转录组数据(IDPRJNA235353)，通过功能注释结果，从中筛选出水通道蛋白Unigene基因。利用本地blast方法将筛选出的Unigene与条斑紫菜的EST数据库、CDS数据库、基因组数据库进行比对，比对上后进行拼接延伸。将拼接后的序列，在NCBI的ORFFinder上进行预测。

表1　条斑紫菜不同的处理条件

注：a低山梨醇与高渗，产生的渗透压是相同的;b高山梨醇与超高渗，产生的渗透压是相同的。

Note:aTheosmoticpressureoflowsorbitolandhighpermeabilityissame;bTheosmoticpressureofhighsorbitolandultra-highpermeabilityissame.

根据上述拼接序列，利用primer5设计上、下游引物AQPF1、AQPR1 (见表2)，分别以cDNA和DNA为模板进行扩增。扩增程序设置为：94 ℃预变性5min；94 ℃变性45s，58 ℃退火1min，72 ℃延伸1min35s，35个循环；72 ℃延伸10min；4 ℃保存。PCR产物与pMD18-T(TaKaRa)连接后进行亚克隆，蓝白斑筛选，挑选白色菌落，经PCR验证后，将阳性重组质粒送至Invitrogen公司测序。

利用NCBI的ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)网站预测基因的开放阅读框。DNAMAN软件进行氨基酸序列比对，运用在线的软件Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)预测PyAQP1基因编码蛋白的等电点与分子量；Predictprotein中的PhD(http://www.predictprotein.org/submit-meta.html)预测蛋白的二级结构；TMHMM软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测该蛋白的跨膜结构区域；NetPhos软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/)预测蛋白的磷酸化位点。PSORTⅡPrediction软件(http://psort.hgc.jp/form2.html)预测细胞中基因编码蛋白的位置。采用MEGA6.0，以邻位连接(NJ)法构建系统进化树(1 000runs)，进行分子系统学分析。

表2　PCR扩增所用引物及其序列

1.2.4 PyAQP1的亚细胞定位分析

1.2.4.1 瞬时表达载体的构建瞬时表达载体p35S:PyAQP1-GFP的构建采用pBI121载体，利用限制性内切酶XbaⅠ和BamHI将其双酶切，将两端带有XbaⅠ和BamHI酶切位点的目的基因PyAQP1与线性化载体PBI121进行连接。依据In-Fusion引物设计原则，设计PyAQP1F2、PyAQP1R2扩增PyAQP1基因(见表2)。具体操作见clontech的说明书。将连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑取阳性克隆进行测序验证。

1.2.4.2 基因枪介导的亚细胞定位切取2cm×2cm的洋葱内表皮组织，将其放置在固体MS培养基上，28 ℃弱光下预培养4h待用。利用基因枪介导的瞬时转化法将PBI121-PyAQP1-GFP和空载体PBI121-GFP分别导入洋葱表皮细胞中，各做3个重复。基因枪转化步骤参照参考文献[17]。将轰击后的洋葱表皮放入23 ℃暗培养16h后，放入0.6mol/L蔗糖溶液中，使其发生质壁分离，然后用DAPI进行染色处理，制备临时装片，通过尼康荧光显微镜(Eclipse80i,Nikon)分别在白光、绿光(450～490nm)和蓝光(330～380nm)下观察。

1.2.5 PyAQP1基因的qRT-PCR分析利用荧光定量PCR方法检测PyAQP1基因在不同胁迫下(见表1)mRNA水平的表达差异。PCR反应体系如下：单链cDNA模板1μL，上、下游引物各0.2μmol/L，2×SYBRGreenⅠReal-timePCRMasterMix(Roche)10μL，加水补足至20μL。扩增所用引物为PyAQP1F5和PyAQP1R5，内参基因选择为eIF4A和Tubulin，引物分别为eIF4AF3、eIF4AR3和TubulinF4、TubulinR4。每对引物分别做标准曲线和熔解曲线，以排除引物二聚体和非特异性扩增产物对基因的相对表达量造成影响的可能性。利用RocheLightCycler? 480II仪器进行PCR扩增，设置3个生物学重复、2个技术重复，相对表达量的计算利用2-△△ct法[18]。应用Excel和SPSS19.0软件对试验数据进行统计分析，并采用单因素方差分析(One-WayANOVA)和最小差异显著法(LSD)比较不同数据组间的差异，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示极显著差异。

2　结果与分析

2.1 条斑紫菜PyAQP1基因的克隆

将电子克隆所得序列，设计引物进行PCR测序验证，同时在NCBI(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网站对核苷酸序列进行BLASTX分析，以确定ORF的正确性，获得1 151bp碱基序列(GenBank注册号：KT735045)，含1 002bp开放阅读框，编码333个氨基酸(见图1)。根据PyAQP1基因的cDNA序列在阅读框两端设计引物在cDNA和DNA中进行扩增，所得序列进行进一步分析，发现扩增序列含有预期的开放阅读框，基因组序列中含有一个200bp内含子(见图1)。

2.2 条斑紫菜PyAQP1基因蛋白结构分析

Protparam软件预测PyAQP1基因编码蛋白分子量为34.597KD，等电点为6.43。利用Predictprotein中的PhD软件预测蛋白的二级结构显示，PyAQP1由α螺旋(34.53%)、β折叠(10.51%)、无规则卷曲(54.95%)组成。TMHMM软件预测该蛋白有6个跨膜结构区域，跨膜区域的氨基酸位置为65～87、99～118、146～168、220～241、254～276、308～330(见图2)。氨基酸序列分析表明该蛋白含有MIP(Majorintrinsicprotein)家族中典型的保守NPA结构域，由Asn-Pro-Ala3个氨基酸组成的，它们直接参与水通道的形成(见图2)。运用NetPhos软件预测发现，PyAQP1蛋白氨基酸序列包含13个可能的磷酸化位点，其中8个位于丝氨酸(S)上，4个位于苏氨酸(T)上，1个位于酪氨酸(Y)上(见图1)，推测这些磷酸化修饰位点可能与PyAQP1基因蛋白通道的开启与闭合有关。PSORTⅡPrediction分析显示该基因编码的蛋白位于质膜上。

(星号为终止密码子，加粗下划线为磷酸化位点，内含子位置用倒三角标出。Stopcodonismarkedwithanasterisk,thebondwithunderlinespredictedphosphorylationsites,theblackarrowheadsmarkthelocationsofintrons.)

图1PyAQP1基因DNA序列及氨基酸序列

Fig.1DNAsequenceandaminoacidsequenceofPyAQP1

利用MEGA6.0软件，进行分子系统学分析(见图3)。由图中可见，Glps进化树主要分成2大支，莱茵衣藻的Glps和单针藻的Glps(XP013897215.1)聚为一小支，其余的包括假单胞杆菌属的Glps、金色藻的Glps、红藻门的Glps、小球藻属的Glps和小立碗藓的Glps聚为一大支。其中，PyAQP1与龙须菜的亲缘关系最近聚为一小支，再与角叉菜的聚为一支，然后与单细胞红藻、小球藻、小立碗藓的Glps聚在一起。

2.3 PyAQP1基因编码蛋白的亚细胞定位分析

利用基因枪介导的瞬时转化法将PBI121-PyAQP1-GFP和空载体PBI121-GFP分别导入新鲜的洋葱内表皮细胞中，通过在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白信号在细胞内的分布，分析PyAQP1在洋葱亚细胞结构中的分布。结果显示，转化融合表达载体PBI121-PyAQP1-GFP的洋葱表皮细胞中，绿色荧光仅在质膜上表达。转化空载体PBI121-GFP的洋葱表皮细胞中，绿色荧光在细胞质、细胞核和细胞膜上都有表达(见图4)，表明PyAQP1基因编码蛋白定位在质膜上，这与亚细胞定位预测的位置是一致的。

2.4 PyAQP1基因干旱、盐度、温度胁迫响应的qRT-PCR分析

为了探究PyAQP1基因在干露、盐度与温度等不同环境因子胁迫下的表达模式，采用荧光定量PCR方法检测了PyAQP1在转录水平的表达规律。结果表明(见图5)，在失水胁迫下，当失水率达到20%时基因相对表达量最大，达到对照组的9倍左右。随着失水率的增加，基因表达量逐渐降低，当失水率达到80%时，基因的相对表达量约为对照组的4倍。在失水处理的3个阶段，PyAQP1表达水平显著上调(P<0.05)。复水处理是将失水率达到80%后将其放在正常培养海水中复水处理15、30min。随着紫菜细胞逐渐的恢复到原来的状态，基因的相对表达量逐渐上升。复水处理时，PyAQP1表达水平显著上调(P<0.05)。

(星号表示2个保守的NPA；上划线表示6个跨膜区域。TwoconservedNPAmotifsaremarkedwithasterisks;theoverlinesshowsixtransmembrancedomain.条斑紫菜P.yezoensis PyAQP1(KT735045)，假单胞杆菌Pseudomonas deceptionensisGlps(WP048359036.1)，拟南芥Arabidopsis thalianaNIP1-1(NP_567572.1)，玉米Zea maysPIP2-1 (NP_001105024.1)，水稻Oryza sativa SIP2-1(NP_001049950.1)，拟南芥AtTIP2-3(NP_199556.1).)

图2PyAQP1与其他物种中的AQP家族基因的氨基酸序列比对

Fig.2ComparisonoftheaminoacidsequencesofPyAQP1andotherAQPproteins

(小球藻Auxenochlorella protothecoides (Glps)XP011400931.1, 小球藻A.protothecoides (Glps)XP011400934.1, 小立碗藓 Physcomitrella patens (Glps)AAU43833.1, 单细胞红藻 Cyanidioschyzon merolaestrain10D(Glps)XP005536496.1, 角叉菜 Chondrus crispus (Glps)CDF37343.1, 龙须菜 Gracilaria lemaneiformis (Glps)comp50806c0seq1 1-300, 条斑紫菜P.y (PyAQP1)KT735045, 单针藻 Monoraphidium neglectum (Glps)XP13897527.1, 温泉红藻Galdieria sulphuraria (Glps)XP005705771.1, 温泉红藻G.sulphuraria (Glps)EME29251.1, 金色藻ChrysochromulinaspCCMP291 (Glps)KOO24120.1, 假单胞菌Pseudomonas (Glps)WP018614182.1, 南极假单胞杆菌 P.deceptionensis (Glps)WP048359036.1, 荧光假单胞杆菌P. fluorescens (Glps)WP039765828.1, 土壤假单胞菌P.kilonensis (Glps)WP046062607.1, 莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii (Glps)XP001694120.1, 单针藻 Mn (Glps)XP013897215.1, 甲烷热杆菌 Methanothermobacter thermautotrophicus (AQPM)WP_010875742.1)

图3PyAQP1水通道蛋白氨基酸序列系统发生分析

Fig.3ThephylogenetictreeofPyAQP1gene.

(a、d.洋葱内表皮细胞外观图；b、e.荧光显微镜下的绿色荧光信号图；c、f.DAPI染色图。a,d.Out-lookofonionepidermalcells;b,e.GreenfluorescentsignalunderFluo;c,f.DAPIstainingfigure.)

图4PyAQP1亚细胞定位结果

Fig.4SubcellularlocalizationofPyAQP1fusedwithGFP

在盐度处理条件下(见图6)，低于正常海水盐度下的超低渗(盐度为8)与低渗(盐度为16)，随着盐度的降低表达量增加，处理条件低于正常海水盐度33时，PyAQP1表达水平显著上调(P<0.05)。当高于正常海水盐度的高渗(盐度为47)与超高渗(盐度为60)时，随着盐度的增加表达量也降低。当海水盐度为47时，PyAQP1表达水平显著上调(P<0.05)。当海水盐度为60时，PyAQP1的表达水平没有发生显著变化(P>0.05)。在渗透压处理的条件中，增加了山梨醇的处理。低山梨醇处理条件的渗透压与高渗处理条件下的渗透压是一样的，高山梨醇处理条件的渗透压与超高渗渗透压是一样的。山梨醇处理后基因的表达情况与海水盐度为47、海水盐度为60处理条件下的表达趋势是一样的，随着山梨醇浓度的增加，基因的表达量逐渐降低。在低山梨醇处理条件下，PyAQP1表达水平显著上调(P<0.05)，在高山梨醇处理的条件下，PyAQP1的表达水平没有发生显著变化(P>0.05)。

温度处理条件下，在-8℃时，基因的表达量显著增加，约为正常处理条件下的30倍。在0 ℃时，基因的表达量略高于正常处理条件。当温度高于条斑紫菜生长的正常温度时，基因的表达量随着温度的升高，呈现逐渐升高的趋势，且温度处理20 ℃后，增加的趋势较小(见图7)。在温度处理的各个节点处，PyAQP1表达水平显著上调(P<0.05)。

3　讨论

近年来，AQP家族基因的功能已被广泛的报道，但是在条斑紫菜中相关家族基因的功能研究尚未报道。本研究从条斑紫菜中克隆了一个AQP基因(PyAQP1)，其全长为1 351bp，含有1个内含子，编码蛋白氨基酸序列含有典型的MIP(Majorintrinsicprotein)家族中保守NPA结构域，它们可能直接参与水通道蛋白通道的形成[13]。磷酸化是AQP活性调节的一种重要方式，研究表明植物AQP中的PIP、TIP和NIP等亚类都能够被磷酸化，其磷酸化主要是发生于N端或C端的丝氨酸位点[10]。Nyblom等对菠菜水通道蛋白SoPIP2;1的研究发现，水通道蛋白中丝氨酸的磷酸化可以明显提高SoPIP2;1的水分转运活性[19]。本研究中 PyAQP1蛋白氨基酸序列包含13个可能的磷酸化位点，其中8个位于丝氨酸(S)上，4个位于苏氨酸(T)上，1个位于酪氨酸(Y)上(见图1)，多个磷酸化位点的存在可能与PyAQP1功能的发挥有关，可增强AQP调控途径的多样性[20]。生物信息学预测与亚细胞定位均显示，PyAQP1编码蛋白主要定位于质膜上，这与小立碗藓中的Glps定位在质膜上的结果是一致的[21]。Federico等指出Glps一般存在于低等生物藻类、苔藓类中，Glps起源于细菌的水平基因转移(HGT)[22]。系统发生分析显示，PyAQP1与红藻中除温泉红藻的Glps聚为一支，而温泉红藻与绿藻中的小球藻(XP_013897527.1)聚为一支，并进一步与假单胞菌聚在一起。同时绿藻的Glps也并未聚为明显的独立支，推测Glps在进化上具有多重起源进一步的研究需要证实Glps的系统发生关系。

水分胁迫是影响生物生长发育的重要胁迫因子。Alex等研究表明，拟南芥在自然干旱和250mmol/L甘露醇处理条件下，不同的AtPIP基因类型分别呈现出上调或者下调表达模式[23-24]。Lian等发现，20%PEG6000处理抗旱水稻“中旱3号”10h后，水通道蛋白PIP表达增加，而不抗旱水稻“秀水63”的水通道蛋白PIP表达下降[25]。Sarda等研究发现，向日葵叶子中SunTIP7在缺水的情况下表达增加，而其根部的SunTIP1;8表达受到抑制[26-27]。本研究中，条斑紫菜在受到干出胁迫时，表达量都高于正常处理条件下的，但是随着失水量的增加，表达量逐渐降低；在失水率达到80%后进行复水，随着复水时间的增加，表达量也呈现增加的趋势。推测，条斑紫菜水分亏缺条件下，叶片中的水通道蛋白基因表达量升高，引起膜上的水通道蛋白密度增大，继而增加了细胞-细胞途径水分的运输，促进藻体对水分的吸收。当失水率达到一定程度后，编码水通道蛋白的转录本表达量下降，推测是由于此时叶片中水通道蛋白含量已经能满足细胞-细胞途径水分运输的需要，且此时水通道蛋白活性的调控更为重要，从而促进细胞-细胞途径的水分运输。在复水处理过程中，紫菜细胞有原来的失水状态变成正常生理状态，基因表达量增加并高于正常条件，原因可能在于二者细胞所处的微环境不同。正常条件下，细胞水分运输处于平衡失水后的复水恢复阶段，细胞需水量瞬时增加，需要增加水通道蛋白量以增强细胞膜对水的通透能力。

盐胁迫通过影响植物水通道蛋白的表达量和活性，来降低植物根系的吸水能力[28]。当大麦受到NaCl胁迫后根部的HvPIP2;1表达量下降，但HvPIP1;3和HvPIP1;5的表达量未受到影响。Li等用150mmol·L-1NaCl处理水稻后，研究结果表明叶中OsTIP1;1、OsTIP4;1和OsTIP4;2表达量均先下降后上升，而OsTIP1;2 表达升高，OsTIP4;1, OsTIP4;2则是先下降后上升[29]。条斑紫菜自然生长于潮间带，退潮后藻体暴露在空气中，水分蒸发掉后，盐度会增加。Real-timePCR结果显示，在低于正常海水盐度下，基因的表达量是高于正常处理条件的，随着盐度逐渐的降低，表达量呈现增加的趋势；在高于正常海水盐度下，基因的表达量高于正常处理条件，随着盐度的升高，表达量呈现降低的趋势。推测，在低于海水盐度下的环境中，条斑紫菜细胞内的渗透势高于外界环境，为维持细胞活性，紫菜细胞需要从外界吸收水分，水通道蛋白的表达量显著增加。山梨醇处理对水通道蛋白的表达与盐度处理的趋势是一致的。

低温胁迫会使植物细胞造成生理性缺水进而导致严重损伤[24]。研究表明，低温胁迫下，植物水通道蛋白在转录水平呈现出比干旱和高盐更为复杂的情况，其中涉及水通道蛋白的种类与干旱和高盐度胁迫相比更为多样化，PIP、NIP、TIP和SIP基因表达都受到胁迫条件的影响且表达模式相同[24]。Jang等对拟南芥中的PIP亚家族成员的表达情况进行分析，结果表明13个PIP基因对冷胁迫产生响应，除了AtPIP2;5表达呈上升趋势外，其余的12个PIP基因表达都受到抑制[30]。Sakurai等发现水稻中多数水通道蛋白在受到低温胁迫时表达受抑制，随着温度增加，表达逐渐增加[31]。条斑紫菜叶状体的生长发育阶段主要在冬季，最低温度可达8 ℃，保持藻体水分平衡对其存活来说至关重要。本研究结果显示低温与高温处理均使其表达量增加，推测在低温与高温处理时，藻体通过大量的表达水通道蛋白来维持叶片导水率以及体内水分运输，减少植株所受温度胁迫。

4　结语

本研究从条斑紫菜中克隆了一个水通道蛋白基因PyAQP1，开放阅读框为1 002bp，编码一个含333个氨基酸残基的多肽，定位于细胞质膜上，进化分析结果显示PyAQP1属于Glps类。在失水、盐度、温度胁迫下该基因都上调表达。条斑紫菜作为一种研究潮间带藻类生理生态以及逆境胁迫适应机制的代表性模式物种，本文对水通道蛋白的研究能够为揭示条斑紫菜逆境适应机制奠定基础。

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责任编辑高蓓

CloningandExpressionAnalysisofPyAQP1inPyropia yezoensis

YANGJun-Qing1,KONGFan-Na1,LIChao1,BIGui-Qi1,SUNMei-Juan2，ZHAOHai-Long1,LINa1,MAOYun-Xiang1

(1.TheKeyLaboratoryofMarineGeneticsandBreeding,MinistryofEducation,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China;2.DepartmentofPharnacy,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266021,China)

Aquaporinsareancientchannelproteinslocalizedinbiologicalmembranesandfacilitatingwatertransportthroughcellmembranesrapidly.Aquaporinplaysanimportantroleinplantwaterhomeostasisthroughthefacilitationofwatertransportandsolutes.TheredmacroalgaeP. yezoensis,classifiedasBangiophyceae,isasuitablespeciesfortheelucidationofmolecularmechanismsregulatingenvironmentalstressesinmarineredalgae.However,currentlylittleisknownabouttheAQPgenesinP. yezoensis.APyAQP1gene(GINumberisKT735045)wasisolatedthroughtsilicoclone,basedonthetranscriptomicdatainthisresearch.ThefulllengthofPyAQP1containedoneintronwiththesizeof200bp,andanopenreadingframeof1 151bpencoding333aminoacids.Theisoelectricpoints(PI)andmolecularweights(MW)ofthePyAQP1aminoacidsequencewere35.4kDand6.43,respectively.TheanalysisofPyAQP1aminoacidsequencesshowedthatPyAQP1containedtheMIPfamilysignatureNPAmotifaswellassixtransmembraneregions.AnalysisofmultiplesequencealignmentandphylogenetictreeshowedthatPyAQP1sharedverylowsimilaritytoanyotherplantMIPbutasurprisinglyhighsimilaritytoasubclassofbacterialGlps.TheplasmidconstructencodingPyAQP1-GFPunderthecontrolofthe35Spromoterwastransformedintoonionepidermalcellsbyparticlebombardment.ThetransientexpressionanalysisinonionepidermalcellsshowedusthatthePyAQP1proteinwaslocalizedinthecellplasmamembrane,comparedtothecontrol35S::GFPinthenucleus,cytoplasmandplasmamembraneofthecells.Tobetterunderstandtheshort-termexpressionpatternsofPyAQP1inresponsetoabioticstress,qRT-PCRwasusedtoinvestigatetheexpressionpatternsofPyAQP1indifferenttreatmentconditions(salt,droughtandtemperature).Underdroughtstress,theexpressionlevelofPyAQP1decreasedwiththeincrementofthewaterlossrate.Itwasnotingthattheexpressionincreasedwhenrehydrationafterdehydrationreached80%.TheexpressionpatternsofPyAQP1undersorbitolandNacltreatmentwassimilarandtheexpressionlevelofPyAQP1decreasedwithsalinityincreasing.Undertemperaturestress,theexpressionofPyAQP1increasedsignificantlyat-8 ℃,andtheexpressionat0 ℃wasslightlyhigherthannormaltreatment.However,theexpressionofPyAQP1graduallyincreasedwiththetemperatureincreasing,whengrowthtemperatureincreasesby10 ℃.Inthiswork,wereportedtheisolationandexpressioncharacterizationofthePyAQP1geneintheP. yenozesis,whichprovidetheinsightsforunderstandingthemechanismsofPyAQP1respondingtoabioticstresses.

Pyropia yezoensis;aquaporin;subcellularlocalization;Realtime-PCR;abioticstress

国家高技术研究发展计划项目(2012AA10A401；2012AA10A406)资助

2015-12-25；

2016-03-21

杨俊卿(1990-)，女，硕士生。E-mail:yjqouc@163.com

**通讯作者：E-mail:fnkong@ouc.edu.cn

Q945.78

A

1672-5174(2016)08-079-08

10.16441/j.cnki.hdxb.20150425

SupportedbytheNationalHighTechnologyResearchandDevelopmentProgramofChina(2012AA10A401;2012AA10A406)