马急性滑膜炎模型关节液中MMP-3和MMP-13含量变化的研究

王冠颖,姜仁礼,李欣然,范晓静,李玥,刘旭,王晶璐,潘佳亮,陈希,马云峰,赵洋,魏成威,韩光,高利

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030)

马急性滑膜炎模型关节液中MMP-3和MMP-13含量变化的研究

王冠颖,姜仁礼,李欣然,范晓静,李玥,刘旭,王晶璐,潘佳亮,陈希,马云峰,赵洋,魏成威,韩光,高利

(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030)

关节滑膜炎是骨关节疾病发病的基本病理过程,试验通过研究马急性滑膜炎关节液中基质金属蛋白酶-3 (MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(MMP-13)含量的变化,进而研究马滑膜炎机理.试验选用8匹马,在马右侧中间腕关节内注入0.5 ng大肠杆菌脂多糖(LPS)诱导滑膜炎,同时在对侧关节内注入等量的PBS作为对照,于注射药物前和注射药物后的8、24 h和168 h,采马关节液,用ELISA检测马关节液中MMP-3和MMP-13的含量.结果注入LPS的关节液中MMP-3和MMP-13的量在注射后的24 h内持续升高,在24 h达到最大量10.01 ng/mL和6.08 ng/mL,与对照组比较差异性显著,24 h后开始下降,168 h时含量恢复到对照水平.试验结果表明,LPS诱导的滑膜炎模型为一过性的,在急性滑膜炎过程中,MMP-3和MMP-13的表达和释放增加,并且这两种酶在滑膜炎过程中起到重要作用.

滑膜炎;脂多糖;基质金属蛋白酶-3;基质金属蛋白酶-13

在马的各种关节疾病中,滑膜炎是比较重要的疾病,滑膜炎程度的加重会造成软骨的降解和退化.近些年来,研究表明,滑膜炎与关节的疼痛和关节功能异常有关,还会促进关节软骨的降解[1].受到滑膜炎影响的关节组织,会产生一些炎症因子和酶类,影响关节内的正常代谢,引起关节软骨的降解退化.因此在对关节疾病机理研究中,滑膜炎机理的研究是比较重要的.而在促进关节软骨退化的各类酶中,基质金属蛋白酶(MMPs)起到重要的作用.本试验通过用试验的方法诱导马腕关节的急性滑膜炎,检测在滑膜炎过程中关节液中基质金属蛋白酶-3和13含量的变化,揭示滑膜炎过程中软骨退化的机理,为今后相关研究和预防这类疾病奠定基础.

1　材料与方法

1.1试验材料年龄在5～8岁的马8匹,购自肇

东市某养殖场.按试验动物要求饲养管理,临床检查健康.盐酸地托咪定、盐酸美沙酮及大肠杆菌O55∶B5脂多糖,购自Sigma公司;MMP-3和MMP-13 ELISA试剂盒,购自Shsaimo公司.

1.2试验方法

1.2.1诱导滑膜炎给马静脉注射盐酸地托咪定(10 μg/kg体重)和盐酸美沙酮(0.1 mg/kg体重),进行镇静.用PBS将大肠杆菌O55∶B5脂多糖(LPS)稀释为0.5 ng/mL,在马的右侧中间腕关节内注入1 mL稀释液,诱导滑膜炎.作为对照关节,在马的对侧关节中间腕关节内注入等量的PBS.

1.2.2关节液收集在关节内注射药物前和在注射药物后的8、24 h和168 h,给马静脉注射盐酸地托咪定(10 μg/kg体重)和盐酸美沙酮(0.1 mg/kg体重),进行镇静,用注射器无菌抽取马中间腕关节关节液,将关节液离心10 min(10 000 r/min),取上清液分装入EP管中,-80℃保存.

1.2.3临床症状的监测每次采集完关节液,记录马的体温、呼吸、脉搏,并且进行跛行评估,评估标准参照美国马兽医协会(AAEP)制定的跛行分级标准[2],如表1所示.

表1　马的跛行分级

1.2.4MMP-3和MMP-13的检测用ELISA试剂盒检测这4个时间点关节液中MMP-3和MMP-13的含量,按照试剂盒说明书进行操作.

1.3统计学分析数据用平均值±标准差表示.使用SPSS 19软件数据分析系统做单因素方差分析,P<0.05为差异性显著.

2　结果

2.1临床结果这8匹马的体温、呼吸、脉搏在168 h内均在正常范围内.而所有动物在注射药物后4 h开始出现跛行,在8 h达到二级跛行,在24 h出现一级跛行,在168 h恢复正常.

2.2关节液中MMP-3的含量如表2所示:与对照关节相比,注入LPS的关节关节液中MMP-3的量在注射后的24 h内持续升高,在24 h达到最大量10.01 ng/mL,与对照组比较差异性显著,在168 h含量恢复到对照水平.

表2　关节液中MMP-3的含量

2.3关节液中MMP-13的含量如表3所示:与对照关节相比,注入LPS的关节关节液中MMP-13的量在注射后的24 h内持续升高,在24 h达到最大量6.08 ng/mL,与对照组比较差异性显著,在168 h含量恢复到对照水平.

表3　关节液中MMP-13的含量

3　讨论

马滑膜炎通常为其他关节疾病的开端,许多试验研究表明,在马的骨关节炎过程中滑膜炎是早期发病过程,这种发病过程会引起马关节疼痛,还会使一些介质的产生增加,促进关节炎的发展,这些介质包括基质金属蛋白酶、胶原酶、前列腺素、自由基等[3-5],继而引起关节软骨降解.

在本试验中,在马右侧关节内注入大肠杆菌脂多糖,引起关节滑膜中滑膜细胞分泌一些炎症介质,引发马的滑膜炎,但是这种滑膜炎是急性的一过性的,整个炎症过程持续一周,马的跛行也在一周内恢复.在24 h内,马出现跛行,表明此过程中出现剧烈的炎症反应,而在此过程中检测到马关节液中MMP-3和MMP-13的量持续升高,达到10.01 ng/mL和6.08 ng/mL,与对照组有显著的差异.有研究表明,体外培养马的关节组织,用炎症因子IL-1β刺激培养的组织,发现MMP-3的活性增加[6],同时IL-1β还可以诱导软骨细胞中MMP-13的表达[7-8].这表明,在滑膜炎过程中,一些炎症因子诱导MMP-3和MMP-13的表达和分泌,同时这两种酶参与整个炎症过程.

还有报道,基质金属蛋白酶是一类Zn2+依赖性的内肽酶,这类酶参与关节软骨的降解[9],并且基质金属蛋白酶-3和基质金属蛋白酶-13是这类降解酶中比较重要的酶[10-11],滑膜细胞和软骨细胞都可以表达这种酶类.这表明,在滑膜炎过程中出现的关节软骨降解可能与这两种基质金属蛋白酶有关.同时,在试验中,对照关节中酶含量几乎没有变化,这说明滑膜穿刺对MMP-3和MMP-13的表达没有显著影响.

4　结论

在急性滑膜炎中,马关节液中MMP-3和MMP-13的表达和释放增加,这表明这两种酶与骨关节炎初期软骨的损伤有关,在关节软骨退化过程中发挥重要作用.

[1]Scanzello C R,Goldring S R.The role of synovitis in osteoarthri⁃tis pathogenesis[J].Bone,2012,51:249-257

[2]Ross M W.The lameness score:quantification of lameness severity [J].In Diagnosis and Management of Lameness in the Horse Edited by:Ross M W,Dyson S J.Philadelphia:W B Saunders,2003,66-67.

[3]Balkman C E,Nixon A J.Molecular cloning and cartilage gene ex⁃pression of equine stromelysin 1(matrix metalloproteinase 3)[J]. Am J Vet Res,1998,59:30-36.

[4]Trumble T N,Trotter G W,Oxford J R,et al.Synovial fluid gela⁃tinase concentrations and matrix metalloproteinase and cytokine expression in naturally occurring joint disease in horses[J].Am J Vet Res,2001,62:1467-1477.

[5]Takafuji V A,McIlwraith C W,Howard R D.Effects of recombi⁃nant equine interleukin-1 alpha and interleukin-1 beta on proteo⁃glycan metabolism and prostaglandin E2 synthesis in equine artic⁃ular cartilage explants[J].Am J Vet Res,2002,63:551-558.

[6]Morris E A,Treadwell B V.Effect of interleukin 1 on articular cartilage from young and aged horses and comparison with metab⁃olism of osteoarthritic cartilage[J].American Journal of Veterinary Research,1994,55:138-146.

[7]Orth M W,Peters T L,Hawkins J N.Inhibition of articular carti⁃lage degradation by glucosamine-HCl and chondroitin sulphate [J].Equine Veterinary Journal,2002,34:224-229.

[8]Caron J P,Fernandes J C,Martel Pelletier J,et al.Chondropro⁃tective effect of intraarticular injections of interleukin-1 receptor antagonist in experimental osteoarthritis.Suppression of collage⁃nase-1 expression[J].Arthritis and Rheumatism,1996,39:1535-1544.

[9]McIlwraith C W.General pathobiology of the joint and response to injury[J].In:Mc Ilwraith C W,Trotter G W,eds.Joint diseas in the horse.Philadelphia:W B Saunders Co,1996,40-70.

[10]Brama PA J,TeKoppele J M,Beekman B,et al.Influence of de⁃velopment and joint pathology on stromelysin enzyme activity in equine synovial fluid[J].Ann Rheum Dis,2000,59:155-157.

[11]Tardif G,Pelletier J P,Dupuis M,et al.Collagenase 3 production by human osteoarthritic chondrocytes in response to grow th fac⁃tors and cytokines is a function of the physiologic state of the cells [J].Arthritis Rheum,1999,42:1147-1158.

Changes in synovial fluid MMP-3 and MMP-13 from horses w ith experimentally-induced synovitis

WANG Guan-ying,JIANG Ren-li,LI Xin-ran,FAN Xiao-jing,LI Yue,LIU Xu,WANG Jing-lu, PAN Jia-liang,CHEN Xi,MA Yun-feng,ZHAO Yang,WEI Cheng-wei,HAN Guang,GAO Li
(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

To study the synovitis mechanism of the horse,changes in synovial fluid MMP-3 and MMP-13 from horses with acute synovitis were analyzed.Acute synovitis was induced in 8 skeletally mature mares by a sterile intra-articular injection of 0.5 ng lipopolysaccharide(LPS)into the right middle carpal joint.The same doge sterile PBS was injected into the left control joint.Sy⁃novial fluid was collected at post injection hours(PIH)0,8,24 and 168.Concentrations of MMP-3 and MMP-13 were measured using ELISA kit.Our reslts showed that MMP-3 and MMP-13 increased steadily through PIH 24,and peaked at PIH 24 with the amount of 10.01 ng/mL and 6.08 ng/mL.The differences were significantly when compared with control group MMP-3 and MMP-13 returned to baseline by PIH 168.The results indicate injections of LPS into equine carpal joints resultes in a transient inflammatory response,and the expression and release of MMP-3 and MMP-13 are increased in acute synovitis.

synovitis;lipopolysaccharide;MMP-3;MMP-13

GAO Li

S857.165

A

0529-6005(2016)02-0028-03

2014-09-15

国家科技支撑计划资助(2012BAD46B02-03)

王冠颖(1988-),女,硕士,从事临床兽医学方向研究,E-mail:misswang1988@sina.com

高利,E-mail:gaoli43450@163.com