血清锰含量测定方法的改进

米俊宪,张磊,皇甫和平,叶晓敏(河南牧业经济学院动物医学系,河南郑州450046)

血清锰含量测定方法的改进

米俊宪,张磊,皇甫和平,叶晓敏
(河南牧业经济学院动物医学系,河南郑州450046)

为了达到简化操作流程、缩短检测时间的目的,本试验从样品的前处理、甲醛肟试剂添加量、反应温度、反应时间等方面对国标测定水中锰含量的方法作出改进.试验结果表明,采用干湿结合法对血清进行前处理可缩短处理时间,减少盐酸挥发给人体带来的伤害;甲醛肟试剂最佳添加量为3 mL,最佳反应时间为30 min;最低检测限达5 μg/L.改进后的检测方法操作相对简单、检测时间短、检测结果准确,值得推广应用.

血清锰;测定;分光光度法

锰是动物所必需的微量元素,大量研究表明,锰在动物机体中有重要营养作用,它是精氨酸激酶、丙酮酸梭化酶的重要组成部分,也是部分激酶、转移酶、水解酶等的激活剂,具有促进生长、增强免疫力和提高动物繁殖性能等作用[1],对动物产生的副作用也较小[2].因此,有必要对动物体内锰的含量进行测定研究,并最终在生产中更准确、更科学地评价动物的锰营养状况并满足其锰营养需要,从而最终达到促进动物健康、高效生产的目的.而现有的测定方法或者需要繁杂的样品预处理[3],或者干扰因素多,或者灵敏度低,或者设备仪器昂贵[4]故而设计了本试验.本试验针对国标测定水中锰含量的方法(GBT 8538-2008-4.16)作出改进,以达到简化操作流程、缩短检测时间的目的.并用此方法来检测血清中锰含量,与原子吸收光谱法测定结果比较,判定其准确性[5].

1　材料与方法

1.1试剂硫酸亚铁铵溶液:称取70 mg硫酸亚铁铵[(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O],加入10 mL硫酸溶液(1+ 9),用去离子水稀释至1 000 m L;氢氧化钠溶液(160 g/L):称取160 g氢氧化钠(NaOH),溶于去离子水,并稀释至1 000 mL;甲醛肟试剂:称取10 g盐酸羟胺(NH2OH.HCL)溶于50 mL去离子水中,加入5 mL甲醛溶液(p20=1.08 g/ml),用去离子水水稀释至100 mL,将试剂保存在阴凉处,至少可保存1个月;EDTA-Na2溶液(372 g/L):称取37.2 g EDTANa2,加入约50 mL氢氧化钠溶液搅拌至完全溶解,用纯水稀释至100 mL;氨水溶液(35+100):量取70 mL氨水(p20=0.88 g/mL),用去离子水稀释至200 mL;盐酸羟胺溶液:称取41.7 g盐酸羟胺(NH2OH.HCL),溶于去离子水并稀释至200 mL;氨性盐酸羟胺溶液:将氨水溶液和盐酸羟胺溶液等体积混合即成;锰标准贮备溶液(1 mg/mL):称取1.2912 g氧化锰(MnO,优级纯),加硝酸溶液(1+1)溶解后,用纯水定容至1 000 mL,摇匀备用;锰标准使用溶液(10 μg/mL):吸取5.0 mL锰标准贮备溶液,用纯水定容至500 mL.

1.2试验器材722N型分光光度计(由苏州市莱顿科学仪器有限公司生产);FA2004型电子天平(上海精密仪器厂生产);SX2-4-10型马福炉(由天津天有利科技有限公司生产);水浴锅.

1.3不同甲醛肟试剂添加量对测定结果的影响

取150 mL锥形瓶6个,各加入50.0 mL锰标准使用溶液和1.0 mL硫酸亚铁胺溶液,再分别加入0.5 m L、1.0 m L、1.5 m L、2.0 m L、2.5 m L、3.0 m L甲醛肟试剂,混匀.然后各加入0.5 mL EDTA-Na2溶液,并立即加入1.5 mL氢氧化钠溶液,混匀后静置10 min.再加入3 mL氨性盐酸羟胺溶液,至少放置1 h,于450 nm波长下,用1 cm比色皿以纯水为参比,测定各溶液的吸光度[3].

1.4不同反应温度对测定结果的影响取150 m L锥形瓶8个,各加入50.0 m L锰标准使用溶液和1.0 mL硫酸亚铁胺溶液,再加入1.0 mL甲醛肟试剂,混匀.然后各加入0.5 mL EDTA-Na2溶液,并立即加入1.5 mL氢氧化钠溶液,混匀后静置10 min.再加入3 mL氨性盐酸羟胺溶液,将溶液混匀后分别置于室温、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴锅中,1 h后取出冷却,于450 nm波长下,用1 cm比色皿以纯水为参比,测定各溶液的吸光度.

1.5不同反应时间对测定结果的影响操作方法同1.4,室温下每隔10 min于450 nm波长下,用1 cm比色皿以纯水为参比,测定各溶液的吸光度.

1.6不同前处理对样品检测结果的影响将待测样品(健康成年犬血清)采用下列不同处理方法,测定其锰含量,并作比较[6].

不作处理:将采集静脉血分离得到的血清直接进行测定.

干消化法:取样品于坩埚中,加1 mL硝酸,待黄烟消逝后,移入马福炉200℃炭化2 h,然后将温度升至500℃,继续炭化6 h,冷却,取出加0.12 mL硝酸溶样,转入10 mL比色管,定容.

湿消化法:取样品于50 mL比色管,加浓硝酸2 m L,少顷冒黄烟,待试样近溶解,置于马福炉上消解,消化液呈浅黄色,加双氧水3～5滴,反复几次,直至样品呈无色透明.转移至10 mL比色管,定容.

干湿结合法:取样品1 mL于锥型瓶中,加纯水至50 mL水样,再加0.5 mL硝酸,0.25 mL过硫酸钾,放入玻璃珠数粒,在电炉上煮沸30 min,取下稍冷,用快速定性滤纸过滤,用硝酸溶液洗涤滤纸数次.滤液中加入0.5 mL亚硫酸钠,用纯水定容至50 m L,作为测试溶液[7].

1.7测定范围的确定取150 mL锥形瓶12个,分别加入锰标准使用溶液0、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mL,各加去离子水至50 mL.再加入1.0 mL硫酸亚铁胺溶液和1.0 mL甲醛肟试剂,混匀.然后各加入0.5 mL EDTA-Na2溶液,并立即加入1.5 mL氢氧化钠溶液,混匀后静置10 min.再加入3 m L氨性盐酸羟胺溶液,将溶液混匀,30 min后于450 nm波长下,用1 cm比色皿以纯水为参比,测定各溶液的吸光度.绘制吸光度曲线,判断本检测方法的测定范围[8].

1.8准确性分析取含锰10 mg/L的标准溶液和健康成年犬血清各1 mL,加去离子水至50 mL,再按照1.5的方法测定其吸光度,计算出锰含量,并与用原子吸收法测定结果比较,判断其准确性[9]. 1.9干扰试验在含锰10 mg/L的标准溶液中分别加入1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的铜、锌、铁、钠、钾、铅、钙、镁、钴,用以上试验方法确定最佳反应条件,测定各溶液的吸光度值,判断以上物质对测定结果的影响[10].

2　结果与分析

2.1不同甲醛肟试剂添加量对测定结果的影响

不同甲醛肟试剂添加量测得溶液吸光度值如表1和图1所示.从图1可以看出,在反应溶液中添加1 mL甲醛肟试剂时测得的吸光度值最高,即此时显色效果最好.

2.2不同反应温度对测定结果的影响见表1.

从表1可以看出,随着反应温度的升高,测定结果变化值不大,说明温度对显色反应的影响较小.而随着温度的升高,溶液的挥发量也逐步增大,溶液中锰的浓度也会随之发生微量变化,为保证测定结果的准确性,反应宜室温下进行.

2.3不同反应时间对测定结果的影响从图2可以看出,反应时间达到30 min以上,测定结果逐步稳定,说明此时显色稳定.

图1　不同甲醛肟试剂添加量测得溶液吸光度值

表1　不同反应温度对测定结果的影响

图2　不同反应时间测得溶液吸光度值

2.4不同前处理对样品检测结果的影响对不同的前处理样品进行5次平行检测,其吸光度值如表2.

表2　不同前处理对样品检测结果的影响

从表2可以看出,不作处理的样品检测结果比干消化法和湿消化法处理的略低,但它们之间差异不显著(t检验).采用干湿结合法处理的样品检测结果相差也不大,而这种方法处理时间短,且处理过程中强酸的挥发量大大降低,减少了对人体的伤害.

2.5测定范围不同浓度锰溶液测得吸光度值如图3所示.

从图3可以看出,在测定试验范围内,锰浓度>0.10 μg/L时,吸光度曲线呈近似直线,用Microsoft Office Excel计算所得线性方程为y=0.0343x+0.0543, R2=0.9991,说明方程与曲线拟合程度较高.根据方程可推导出公式x=29.1545y-1.5831,即可根据溶液测得的吸光度值y,计算出溶液的含锰量x.若样品量为1 mL,则最低检测限为5 μg/L.

2.6测定方法的准确性测定含锰100 μg/L的标准溶液和健康成年鸡血清吸光度值,并计算所得锰浓度为100.1218±0.2171 μg/L和100.2132 μg/ L.而用原子吸收光谱法测定其锰含量分别为100.0265 μg/L和100.1520 μg/L,与本试验方法测定结果差异不显著(t检验),说明本试验方法准确性好,可靠程度较高.

2.7测定方法的抗干扰性1、5、10、50、100 mg/L的铜、锌、钴测得:铜超过5 mg/L,镍超过2 mg/L,锌超过锰浓度50 mg/L时对本法有干扰.在盐酸羟胺和乙二胺四乙酸二钠存在下,25 mL溶液中分别含有5 mg Cu2+、Fe3+、Mg3+、Al3+、Zn2+、Ca2+则对本试验无明显干扰.

图3　不同浓度锰标准使用液吸光度值

3　讨论

本方法标准曲线线性关系好,判定系数R2= 0.9991,显色几乎不受温度影响.

由结果可看出,甲醛肟的不同添加量对测定的吸光度值有不同程度的影响,其添加量为1 mL时所测得的吸光度值最高、显色效果最好.波长选择在450 nm所测的吸光度值最准确最能保证相对较高的灵敏度.温度虽然影响不大但过低过高都不利于反应的进行,最适宜的是在室温下进行.反应时间影响着显色的稳定性以及测定结果的稳定性,由于锰(Ⅱ)与甲醛肟形成的配合物是无色的,但是能立即被空气中氧氧化为褐红色的锰(Ⅳ)一甲醛肟,因此,操作时需静置10 min,以使显色完全.由本次试验测得放置时间在30 min后测得的结果稳定而且准确度也高,但超过l2 h后其稳定性同样会降低.

在本次试验中重点对样品前处理的方法进行了比较分析,由试验结果可以看出,不同的前处理方法所测定的结果相差不大,它们都适用于血清锰的检测,但它们在时间上,操作的简便程度上以及对人体健康方面的影响却有着差别.干灰化法所需时间长,耗能大,需特定设备.湿式分解法在处理样品过程中不易损失金属元素,所需时间也短,有较高的准确度和重现性,方法操作简单,易于掌握,但费试剂,还可能带来试剂、容器和环境的污染以及某些元素挥发损失;干湿结合法,没有污染、吸附等问题,操作简单,分析偏差小,准确度高,是一种理想的方法.数据表明,本方法不仅可以减少化学试剂的消耗量,缩短消化时间,而且处理效果可以达到湿消化法和国标干消化法的水平.

在测定范围内根据吸光度值绘制标准曲线,可在标准曲线图中查出溶液中的含锰量.该方法测得的数据准确性好,可靠程度高,可予以推广.

采用干湿结合法所测的结果受铜、锌、铁、钠、钾、铅、钙、镁、钴等离子的干扰不明显且干扰离子容易消除.当含铁量较高时,可加入EDTA掩蔽.准确度高,重现性较好.由此可以看出,本法不仅具有较高的灵敏度,而且具有较好的选择性,可直接用于血清中痕量锰的测定.

4　结论

本试验对国标测定水中锰含量的方法作了改进,试验结果表明,采用干湿结合法对血清进行前处理可缩短处理时间,减少由于强酸挥发给人体带来的伤害;甲醛肟试剂最佳添加量为3 mL,最佳反应时间为30 min;最低检测限达5 μg/L.改进后的检测方法操作相对简单、检测时间短、检测结果准确,值得推广应用.

[1]张金环,甄二英,张艳铭,等.锰的营养学研究进展[J].饲料博览,2005(02):36-37.

[2]井明艳,孙建义,许梓荣.锰的生物学功能及有机态锰的应用研究[J].饲料博览,2004(01):54-59.

[3]李昌厚.原子吸收分光光度计仪器及应用[M].北京:科学出版社,2006:184-189.

[4]叶锡模.分析化学手册(二分册,化学分析)[M].杭州:浙江大学出版社,1993:45-46.

[5]袁惠娟,张皓宇,常海清.火焰原子吸收光谱法测定芝麻中铜铁锰锌消化方法比较[J].理化检验-化学分册,2001,37 (3):137-138.

[6]郑树贵,郭东新,曹松屹,等.不同前处理方法对测定植物性饲料微量元素铜、铁含量的影响[J].中国饲料,2006(15): 92-93.

[7]周信基,袁捷,Craig,et al.用原子吸收分光光度计自动湿化法测定动物组织中七种元素[J].中国畜牧兽医,1986(03):23-25.

[8]Belcher R.AmplificationReaction[J].Talanta,1968(15):357-358.

[9]Amir Besada,Gawarigious Y A,Kareem S Y.Miero and Sub⁃mieru Iodometric Detemination of Arenite and Sulphire Ions by Amp lification Reactions[J].Talanta,1976 23(07):392-394.

[10]熊海军,肖的,李光辉,等.对饮用水中锰分光光度测定方法的改进[J].环境与健康杂志,2000(04):37-38.

S852.5+3

A

0529-6005(2016)02-0040-04

2014-06-25

米俊宪(1982-),男,助教,硕士,从事临床兽医学工作,E-mail:mijx02@163.com