苏中地区猪大肠杆菌的耐药性与耐药基因的试验

颜友荣,方向红,王琳琳(江苏省农牧科技职业学院,江苏泰州225300)

苏中地区猪大肠杆菌的耐药性与耐药基因的试验

颜友荣,方向红,王琳琳
(江苏省农牧科技职业学院,江苏泰州225300)

为分析苏中地区猪大肠杆菌的血清型、耐药谱和毒力基因的关系,从苏中地区猪相关病料中分离出已定型的145株E.coli,其中O9、O45、O107和O139为优势血清型.采用琼脂稀释法测定其对14种抗菌药的敏感性,通过多重PCR方法检测耐药性最严重的氨基糖苷类和四环素类各4种毒力相关基因.结果显示,几乎所有菌株对氟苯尼考、多西环素和四环素高度耐药,而对头孢曲松高度敏感,其中多重耐药菌株多数耐5种以上药物,常见的多重耐药表型是氟苯尼考/氯霉素/多西环素/四环素/氨苄西林.PCR鉴定结果表明,含有毒力基因的菌株中38%至少具有两个毒力基因,其中EAST1+Stx2e和hlyF+Stx2e比较常见.比较常见的毒力基因为Stx2e和EAST1,STb基因仅在一株菌中检测到.

大肠杆菌;耐药性;毒力基因;耐药图谱

大肠杆菌病是一种重要的人畜共患病,该菌通常紧密粘附于肠上皮细胞的表面或嵌入肠上皮细胞表面的凹陷中,使黏膜呈特征性损伤,局部微绒毛萎缩,肠黏膜坏死,进而形成溃疡[1].根据毒力特征和所致疾病症状的不同,至少可分为3种类型,产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)、志贺毒素大肠杆菌(STEC)和粘附与脱落性大肠埃希菌(AEEC).ETEC主要通过其表面的粘附素,如K88、K99、987P和F41等粘附于小肠上皮细胞,随后分泌热敏肠毒素(LT)或耐热肠毒素.

1　材料与方法

1.1菌株来源145株试验大肠杆菌来自于苏中地区兽医站、养殖场、动物医院疑似大肠杆菌感染的病死猪,无菌采集其有明显病变的肝、心、脾、肺等病料.经分离培养和鉴定,实验室保存备用.

1.2试验材料试验药物:阿莫西林、头孢唑啉、头孢噻肟、恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、壮观霉素、土霉素、四环素、金霉素、甲氧苄氨嘧啶、安普霉素.

1.3药敏试验参照美国临床实验室标准化协会(CLSI 2010版)的指导原则和执行标准.

1.4判定标准以CLSI文件为指导原则,以敏感、中介、耐药3种形式对MIC值做出判定.同时检测其多重耐药性.

1.5毒力基因与耐药性的关系根据药敏试验结果调查苏中地区猪大肠杆菌中针对耐药性较普遍抗生素的耐药基因情况,找出其规律并研究毒力基因与耐药性的关系.由于本试验中苏中地区猪大肠杆菌对氨基糖苷类和四环素类药物的耐药率较高,因此,采用多重PCR方法检测4种氨基糖苷类耐药基因aad A1、aa C2、aac4、aph A3[1]和3种四环素类耐药基因tet A、tet C以及tet M的流行情况.

2　结果

2.1145株猪源致病性大肠杆菌的药敏试验测定结果大肠杆菌是引起仔猪的腹泻性死亡的最常见的因素,而临床上对猪大肠杆菌病的治疗通常采用的方法是用抗生素.因此,本试验对14种常见药物的耐药性进行了检测(见表1和表2),结果表明,绝大部分的菌株对头孢唑啉和头孢噻肟敏感.而耐药性最高的是四环素类和氨基糖苷类.耐药性均达到了70%以上.

表1　145株猪大肠杆菌对14种抗菌药物的MIC值范围及MIC50和MIC90

表2　145株猪大肠杆菌的多重耐药率

表3　8种耐药基因的检测结果

2.2多重耐药性检测结果从表3可以看出,大肠杆菌的所有分离株中都表现不同程度的多重耐药性,至少有3耐,最多的14耐.在这些菌中10耐、11耐、12耐菌株居多,分别为15.86%、19.31%、22.07%, 8耐和9耐菌株占分离株的11.03%、9.66%.

2.3猪源大肠杆菌的耐药基因检测结果所有定型血清型中,O9、O45、O107和O139为优势血清型,所有优势血清型对氨基糖苷类和四环素类药物耐药,其中O9血清型菌株的耐药性呈6-13耐,且87%以上对四环素、环丙沙星、恩诺沙星和氯霉素耐药;而73%以上的菌株对安普霉素,阿米卡星和多黏菌素E敏感.PCR扩增结果显示,所有O9血清型菌株均含有aad A1、tet M基因,60%的菌株拥有Stx2e和53%的菌株拥有eae A和sta基因, 40%的含有F4基因.O45血清型菌株呈4-13耐,其中所有菌株对环丙沙星、恩诺沙星、氯霉素和四环素耐药,但对头孢唑啉和头孢噻肟敏感.携带的毒力基因主要有:ast A(82%)、Stx2(e82%)、eae A(45%)和sta(45%).

经PCR和琼脂糖凝胶电泳分析,aad A 1 26.7%、aa C 2 10.0%、aa C 4 0.0%、aph A 3 0.0%、aa⁃d A 1/aa C 4 6.7%、aad A 1/aph A 3 0.0%、aa C 2/aa C 4 3.3%、aad A 1/aa C 2 33.3%、aad A 1/aa C 2/aph 3 0.0%、aad A 1/aa C 4/aph 3 3.3%、aad A 1/aa C 2/aa C 4 3.3%、aad A 1/aaC 2/aa C 4/aph 3 3.3%;tet A 10.0%、tet C 20.0%、tet M 6.7%、te A/tet C 3.3%、tet A/ tet M 10.0%、tet C/tet M 10.0%、te A/tet C/tet M 6.7%.

3　讨论

甲氧苄氨嘧啶较敏感是由于他在苏中地区的兽医临床上使用的时间较短的缘故.而敏感菌株大多数来自于管理模式较为落后的养殖场.

氨基糖苷类药物耐药机制有3种,分别是降低药物吸收或降低药物在细胞膜的通透性;改变核糖体的结合位点;产生药物功能集团灭活酶.第3种是氨基糖苷类药物耐药的普遍机制,细菌能产生50多种分别编码乙酰转移酶、腺苷转移酶和磷酸转移酶的基因[2].

除了四环素的广泛应用之外,位于接合质粒或接合转座子上四环素耐药基因的转移也是耐药性产生的主要原因之一[3].通过调查发现,本研究中的大肠杆菌中有96.7%的四环素耐药菌株携带tet A基因,这与国外的某些报道一致,Kim等扩增了2000-2005年间从韩国分离到的致病性大肠杆菌中的tet (A)和tet(B)基因,结果分别有78.4%和13.7%的菌株这两种耐药基因的克隆结果为阳性[4].此外,Bryan等对从美国的人和各种动物体内分离的大肠杆菌进行了四环素耐药基因携带情况的调查,结果也表明,tet(A)和tet(B)为最主要的四环素耐药基因(携带率分别为35%和63%)[5].

tet(M)基因在对四环素耐药的革兰阳性菌中多见,而在革兰阴性菌尤其是大肠杆菌中的研究资料则相对较少.2004年Bryan等首次报道从鸡和猪体内分离的大肠杆菌中克隆到了tet(M)基因[5],2006年Jones等首次证实了人临床大肠杆菌分离株中tet (M)基因的存在[6],但在国内目前尚未见大肠杆菌携带tet(M)基因的文献报道.在本试验中,28%的大肠杆菌耐药菌株携带有tet(M)基因,并且这些菌株还同时携带有tet(A)基因,其原因可能与tet(M)位于结合转座子上,而结合转座子可以转座多个四环素耐药基因有关[6].另外,在本试验中没有检测到单个的只携带tet(M)基因的耐药菌株,因此tet(M)基因在大肠杆菌对四环素耐药机制方面的作用需进一步深入的研究.

[1]张安云,王红宁,周万蓉,等.用四重PCR方法检测野生动物分离细菌对氨基糖苷类药物的耐药基因[C].中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第12次学术研讨会论文集.井冈山:中国畜牧兽医学会动物传染病学分会,2007:1087-1090.

[2]George A M.Multidrug resistance in enteric and other Granr nega⁃tive bacteria[J].FEMS Microbiology Letters,1996,139(1):1-10.

[3]Roberts M C.Update on acquired tetracycline resistance genes[J]. FEMS Microbiology Letters,2005,245(2):195-203.

[4]Kim T E,Jeong Y W,Cho S H,et al.Chronological study of anti⁃biotic resistances and their relevant genes in Korean avian patho⁃genic Escherichia coli isolates[J].Journal of Clinical Microbiolo⁃gy,2007,45(10):3309-3315.

[5]Bryan A,Shapir N,Sadowsky M J.Frequency and distribution of tetracycline resistance genes in genetically diverse,nonselected, and nonclinical Escherichia coil strains isolated from diverse hu⁃man and animal sources[J].App lied and Environmental Microbiol⁃ogy,2004,70(4):2503-2507.

[6]Jones C H,Tuckman M,Murphy E,et al.Identification and se⁃quence of a tet(M)tetracycline resistance determinant homologue inclinical isolates of Escherichia coli[J].Journal of Bacteriology. 2006,188(20):7151-7164.

S852.61

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0529-6005(2016)02-0090-02

2014-04-29

颜友荣(1978-),男,副教授,硕士,从事猪大肠杆菌的研究,E-mail:38539187@qq.com