玉屏风多糖对免疫抑制小鼠红细胞免疫功能的影响

邓桦,杨鸿,仝锡瑶,韩跃飞,计慧琴,蒲文珺

(佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山528231)

玉屏风多糖对免疫抑制小鼠红细胞免疫功能的影响

邓桦,杨鸿,仝锡瑶,韩跃飞,计慧琴,蒲文珺

(佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山528231)

为探讨玉屏风多糖(YPF-P)对环磷酰胺(Cy)致免疫低下小鼠红细胞免疫功能的影响,本试验将90只SPF小鼠随机分为空白对照组、免疫抑制组(Cy 80 mg/kg)、YPF-P不同剂量组(Cy 80 mg/kg+YPF-P 100、200、400 mg/kg)和阳性对照组(YPF-P 200 mg/kg),采用C3b受体花环法和免疫复合物花环法检测红细胞免疫黏附功能,测定血清IL-2和IFN-γ水平.结果发现,Cy可显著降低小鼠的红细胞免疫粘附功能、IL-2和IFN-γ水平,各剂量YPF-P均可较好调节和保护免疫抑制小鼠的红细胞免疫粘附功能,增高红细胞受体花环率和免疫复合物花环率,促进红细胞免疫功能的恢复,同时可显著提升IL-2和IFN-γ水平,调控T淋巴细胞活性.其作用以YPF-P 200 mg/kg最为明显.

玉屏风多糖;免疫抑制;红细胞免疫功能;IL-2;IFN-γ;小鼠

现代免疫学研究证明,红细胞免疫是机体免疫系统的重要组成部分,红细胞是血液循环中最重要的固有免疫细胞,参与机体免疫调控,具有识别、粘附、浓缩、促进吞噬、提呈抗原、激活补体及清除循环免疫复合物等能力,可增强T细胞产生γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)、促进T细胞表达白细胞介素IL-2受体,并有完整的自我调控系统[1-3].

复方是中药的精髓,中药独特用药体系和复方方剂的特点,各组分间良好的量效关系能显著提高单糖的功效[4].玉屏风多糖(YuPingFeng polysaccharides,YPF-P)为玉屏风散总多糖有效部位群,含黄芪多糖、白术多糖和防风多糖等,是该方剂临床药效的主要物质基础.本项目的前期研究已发现YPF-P具有多方面的免疫调控作用[5],但目前玉屏风多糖对红细胞免疫功能影响的研究报道尚较少见.本试验采用环磷酰胺(Cy⁃clophosphamid,Cy),制备免疫抑制小鼠模型,采用红细胞C3b受体花环试验(Red blood cell C3b re⁃ceptor rosetting,RBC-C3bRR)及红细胞免疫复合物花环试验(Red blood cell immune complex roset⁃ting,RBC-ICR),以检测YPF-P对小鼠红细胞免疫功能的影响,同时检测血清IL-2和IFN-γ水平,以观察其对T淋巴细胞功能的影响,旨在为全面评价YPF-P的免疫调控作用提供试验依据.

1　材料与方法

1.1实验动物模型SPF级昆明小鼠,购自广东省医学实验动物中心,合格证书号No.4407207211,雌雄各半.随机分为空白对照组、免疫抑制对照组、多糖阳性对照组、多糖高、中、低剂量组,具体分组和给药剂量见表1.

1.2玉屏风多糖的制备参照文献[6]进行改进.将黄芪、白术、防风按3∶1∶1的重量配方,采用L9(34)正交试验设计优化水提醇沉工艺,经大孔树脂纯化,真空冷冻干燥.经检测玉屏风多糖平均含量为88.93%.

1.3血清IL-2和IFN-γ的测定每组随机选择6只小鼠采样,于11 d摘眼球采血,分离血清.IL-2和IFN-γ按ELISA试剂盒(上海亚培生物科技有限公司,批号12032725)说明书进行检测.

1.4RBC-C3bRR试验

1.4.1C3b致敏酵母悬液制备选用马铃薯葡萄糖培养基培养酵母,用Hank′s液(含钙、镁,pH值7.2,下同)配成含1X108酵母细胞/m L的悬液,离心洗涤后加等量新鲜家兔血清混匀,37℃水浴,致敏20 min,以Hank′s液洗2次,恢复原浓度,即为C3b致敏酵母细胞悬液.

1.4.2小鼠红细胞悬液制备小鼠摘眼球放血,肝素抗凝,离心洗涤3次后,用Hank′s液稀释成1.25X107/mL的红细胞悬液.

1.4.3检测方法取C3b致敏酵母悬液和红细胞悬液各50 μL,混匀,于37℃水浴40 min后取出,轻轻摇起,加0.25%戊二醛溶液20 μL固定5 min,用适量Hank′s液稀释,涂片,干燥,甲醇固定,姬姆萨染液染色,高倍镜检查,以1个红细胞粘附2个或2个以上酵母细胞为1个花环,计数200个红细胞,求出花环率.

1.5RBC-ICR试验酵母用Hank′s液洗涤后无需血清致敏,直接配成1X108/mL浓度,即为非致敏酵母悬液.其余步骤同1.4.2和1.4.3.

表1　实验动物分组和给药剂量

表2　小鼠IL-2、IFN-γ、RBC-C3bRR和RBC-ICR的变化

表2　小鼠IL-2、IFN-γ、RBC-C3bRR和RBC-ICR的变化

注:同列数据右上标小写字母不同者表示P<0.05;大写字母不同者表示P<0.01

动物模型分组多糖剂量(mg/kg)IL-2(pg/m L)IFN-γ(pg/m L)RBC-C3bRR RBC-ICR 1组(空白对照)-34.45±4.0cB75.10±11.4dB10.83±3.3aA9.75±4.1aA2组(免疫抑制对照)-22.19±3.0aA32.79±12.0aA7.38±2.6bA8.14±2.6aA3组(多糖高剂量)400 24.80±3.4aA46.20±8.8bA17.67±5.7cB14.53±3.5bA4组(多糖中剂量)200 28.43±4.4bAB57.17±5.9cB19.56±6.1cB12.71±2.9cA5组(多糖低剂量)100 35.03±7.3cB55.33±5.4cB14.58±7.4dB11.06±5.1cA6组(多糖阳性对照)200 53.34±2.6D73.13±7.1dB35.50±8.6C34.92±7.8B

2　结果

2.1IL-2水平的变化由表2可见,2组IL-2水平为最低,与空白对照组比较P<0.01,与多糖中、低剂量组比较P<0.05,但与高剂量组无明显差异;各剂量组之间比较可见,以低剂量组为高,且明显高于高、中剂量组(P<0.01或P<0.05),中剂量组次之,且高于高剂量组P<0.05,高剂量组为最低.结果提示Cy可显著降低IL-2水平,而此过程可被中、低剂量YPF-P缓解和改善,而剂量过高效果反而下降.6组IL-2水平为所有组别中最高,与1～5组相比P<0.01,提示YPF-P可显著增强正常小鼠的IL-2水平.

2.2IFN-γ水平的变化2组IFN-γ水平为最低,与空白对照组和多糖中、低剂量组比较P<0.01,与高剂量组比较P<0.05;各剂量组之间比较可见,以低、中剂量组为高,与高剂量组相比P< 0.01,高剂量组为最低.结果提示Cy可显著降低IFN-γ水平,而此过程可被中、低剂量YPF-P缓解和改善,而加大剂量并不能持续增加IFN-γ水平.6组显著高于2、3组(P<0.01),与4～5组比较P<0.05,与空白对照组持平.

2.3小鼠RBC-C3bRR的变化2组最低,与1组相比P<0.05,与3～6组相比P<0.01,提示Cy可显著降低小鼠红细胞免疫粘附功能.3～5组与1组相比明显增高(P<0.01),而各剂量组之间,高、中剂量组比低剂量组高(P<0.05),提示高、中剂量可较好保护环磷酰胺所致的红细胞免疫功能下降.6组为最高,与1～5组相比P<0.01,提示YPF-P可显著提升正常小鼠的红细胞免疫功能.详见表2. 2.4小鼠RBC-ICR的变化由表2可见,多糖各剂量组与空白对照组和免疫抑制组相比,3～5组RBC-ICR升高(P<0.05),提示YPF-P可提高小鼠红细胞清除免疫复合物的能力;而各剂量组之间,高剂量组比中、低剂量组升高更为明显(P< 0.05);与1～5组相比,6组RBC-ICR为最高(P< 0.01),提示YPF-P可显著提升正常小鼠的红细胞粘附功能,增强对免疫复合物的清除.

3　讨论

3.1YPF-P对小鼠红细胞免疫粘附功能的调节作用红细胞免疫粘附功能主要是通过其表面I型补体受体CR1,发挥清除免疫复合物的作用,研究红细胞CR1介导的免疫粘附功能对评价机体天然免疫功能状况乃至特异性细胞或体液免疫都具有十分重要的意义[7].本试验结果证实,环磷酰胺可显著降低小鼠红细胞免疫粘附功能,各剂量YPF-P均可较好调节和保护环磷酰胺所致的红细胞免疫粘附功能下降,增高RBC-C3bRR,促进红细胞免疫粘附功能的恢复,提示YPF-P对红细胞免疫粘附功能具有正向调节作用.RBCICR反映了结合状态的CR1数目,与血液中IC含量有关.本试验发现,YPF-P高剂量组和多糖阳性对照组RBC-ICR显著升高,提示YPF-P可显著提升小鼠红细胞粘附功能,增强对免疫复合物的清除,与文献报道一致[4].

3.2YPF-P对小鼠T细胞功能的调节作用有研究发现红细胞对T细胞的生长、存活和分化有调控作用,能促使T细胞分泌IFN-γ和表达IL-2[8-9].本试验结果证实了上述观点,环磷酰胺可显著降低小鼠血清IL-2和IFN-γ水平,而此过程可被YPF-P显著缓解和改善,提示YPF-P可通过平衡红细胞活性以纠正淋巴细胞活性的病理状态.

结合本试验与前期结果分析[5],YPF-P可全面提升机体的免疫功能,对小鼠红细胞免疫、体液免疫和细胞免疫均有明显的调控作用,并存在最佳剂量效应.

[1]郭峰.红细胞天然免疫主干道理论与现代系统免疫学[J].自然杂志,2006,28(2):1-5.

[2]Arosa F A,Pereira C F,fonseca A M.Red blood cells as modula⁃tors of T cell growth and survival[J].Curr Pham Des,2004,10 (2):191.

[3]Fonseca A M,Porto G,Uchida K,et al.Red blood cells inhibit activation-induced cell death and oxidative stress in human pe⁃ripheral blood T lymphocytes[J].Blood,2001,97(10):3152-3160.

[4]乔海博,朱晓庆,谷新利.复方中药多糖对鸡红细胞免疫功能的影响[J].江苏农业科学,2013,41(1):206-208.

[5]邓桦,杨鸿,张兆,等.玉屏风多糖对环磷酰胺免疫抑制小鼠的恢复作用[J].中国兽医学报,2014,34(2):288-292.

[6]陈奇.中药药理研究方法学[M].2版.北京:人民卫生出版社, 2006:756-757.

[7]郭峰.构建现代系统免疫学新的实验研究体系[J].解放军医学杂志,2006,31(2):89-91.

[8]Munford R S,Pugin J.The crucial role of systemic responses in the innate(non-adaptive)host defense[J].J Endotorin Des,2001 (7):327.

[9]Yazdanbakhsh K.Review:complement receptor 1 therapeutics for prevention of immune hemolysis[J].Immunohematol,2005,21 (3):109-118.

Effects of YuPingFeng Polysaccharides on Erythrocyte Immune Function in ImmunosuppressiveM ice

DENG Hua,YANG Hong,TONG Xi-yao,HAN Yue-fei,JI Hui-qin,PU Wen-jun
(College of life science,Foshan University,foshan 528000,China)

To study the effects of YuPingFeng polysaccharides(YPF-P)on erythrocyte immune function in immunosuppres⁃sive mice by cyclophosphamid(Cy),90 mice were randomly divided into 6 groups:blank-control group,immunosuppression-con⁃trol group(Cy 80 mg/kg),YPF-P different dose groups(Cy 80 mg/kg+YPF-P 100,200,400 mg/kg)and positive-control group (YPF-P 200 mg/kg).Red blood cell C3b receptor rosetting assay(RBC-C3bRR)and red blood cell immune complex rosetting as⁃say(RBC-ICR)were used to investigate red cell immune adherence function(RCIA).Serum levels of IL-2 and IFN-γ were detect⁃ed to explore the activity of T lymphocytes.The results showed that RCIA,and serum levels of IL-2 and IFN-γ significantly re⁃duced in immunosuppression mice caused by Cyclophosphamide.All different YPF-P doses could regulate and protect RCIA de⁃cline in immunosuppression mice,heighten the rate of RBC-C3bRR and RBC-ICR,promote the recovery of red cell immune func⁃tion,and significantly increase the level of IL-2 and IFN-γ simultaneously,and regulate the activity of T cells.200 mg/kg YPF-P was the most obvious in those effects.

YuPingFeng polysaccharides(YPF-P);Immunosuppressive;erythrocyte immune function;IL-2;IFN-γ; mice

R 392.3,R 285.5

A

0529-6005(2016)02-0056-03

2014-11-21

广东省自然科学基金项目(S2013010012191)

邓桦(1968-),女,教授,博士,研究方向为基础医学,E-mail:denghuaa@163.com