广西首例牛肺炎支原体的分离和鉴定

陶立,潘艳,李军,许力干,韦志锋,秦若甫,兰美益,杨威,周庆安,陈泽祥(1.广西兽医研究所,广西南宁530001;2.广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001)

广西首例牛肺炎支原体的分离和鉴定

陶立1,2,潘艳1,2,李军1,2,许力干1,2,韦志锋1,2,秦若甫1,2,兰美益1,2,杨威1,2,周庆安1,2,陈泽祥1,2
(1.广西兽医研究所,广西南宁530001;2.广西畜禽疫苗新技术重点实验室,广西南宁530001)

近几年来广西从外省引进肉牛饲养的现象很普遍,因运输应激因素诱发呼吸系统症状的疾病经常发生,临床表现为发热、流涕、咳嗽和呼吸困难,最终导致死亡.给养殖户造成很大的经济损失.为了弄清病因,2013年8月我们对桂林市某牛场出现的类似病例进行了病原调查.该场原有存栏牛336头,2013年7月11日从北方某省引进肉犊牛93头,到场后隔离观察,第3天发现有牛出现喘气,体温升高.随后多数牛也开始发病并出现严重的呼吸困难,卧地不起,拉稀或血样粪便,部分牛最后因衰竭而死.曾用头孢类抗生素治疗无效,整个病程27头牛发病,死亡7头,发病率和病死率分别为29%(27/93)和25.9%(7/27).剖检病死牛,病变局限在胸腔与肺部,肺尖叶、心叶和膈叶都表现出不同程度的红色肉变,肺间质增宽,还可见大小不等的黄白色坏死灶,气管、支气管里有大量的乳白色泡沫.胸腔有少量积液,心包积水,液体呈清亮黄色.其他脏器未见肉眼可见病理变化.经对病原分离培养、形态学观察、生化试验和病原特异性基因PCR检测,鉴定该病病原为牛支原体.

1　材料与方法

1.1试验材料病死牛肝、肾、肺、淋巴结.

1.2试剂和仪器PPLO肉汤粉,购自杭州百思生物技术有限公司;琼脂、TSA琼脂、酵母,购自北京陆桥生物技术有限责任公司;马血清,购自广东蕊特生物科技有限公司;青霉素,购自山东鲁抗医药股份有限公司;细菌微量生化鉴定管和药敏试纸,购自杭州天和微生物试剂有限公司;微量DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司,DNA Marker2、PCR Taq Mix,购自广东东盛生物科技有限公司;PCR仪,购自日本TaKaRa公司;凝胶成像系统,购自美国Alpha Inotech公司.

1.3方法

1.3.1病原分离、形态观察、细菌L型实验和生化性状测定等均按石磊的方法[1]进行.

1.3.2病原PCR鉴定按李大伟的方法[2]进行病原的牛支原体特异性基因opp D/F的PCR鉴定,同时应用牛传染性胸膜肺炎特异性引物对样品进行鉴别诊断[1].将PCR扩增产物连接到pMD-18T载体中,对获得的克隆进行鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序和分析.

1.3.3药敏试验按秦若甫等[3]报道的方法进行.

1.3.4其他细菌的分离无菌取病牛肝、肾、肺、淋巴结分别接种TSA琼脂培养基和兔血营养琼脂培养基,37℃培养48 h观察结果.

2　结果

2.1病原的分离培养和菌落形态初次培养时,将肺组织匀浆后的上清液接种PPLO培养液后3 d,培养基颜色开始变为棕黄色,继续传代培养时,培养基颜色变色时间缩短,在1～2 d,便可由红色变为棕黄,培养液颜色均一,透亮无混浊现象.固体培养基上,2～4 d便可见针尖大小的菌落生长,在4X10倍视野下观察所有平皿均有典型的"煎蛋样"菌落出现,核心较厚,向下长入培养基中,周边为一薄层的透明区(图1).

2.2病原的染色形态观察结果分离的病原革兰染色不易着色,难以观察;姬姆萨染色呈紫蓝色,菌体呈现明显的多形态,多数呈球形,也有少数长短不一的杆状或蝌蚪状的菌体散在分布(图2).

2.3病原生化性状和细菌L型测定病原细菌L型测定无其他细菌形态出现.生化试验结果表明,只能发酵乳糖,不能水解精氨酸,对葡萄糖、木糖、覃糖、七叶苷、蔗糖、尿素和甘露醇均不能分解利用.

2.4PCR鉴定利用牛支原体特异性基因op⁃p D/F F1和F2引物可以从样品中扩增出448 bp的片段,与预期相符,而应用牛传染性胸膜肺炎特异性引物扩增样品则为阴性(图3).

图1　病原菌落观察(4X10)

图2　病原姬姆萨染色观察(10X100)

图3　病原的PCR鉴定结果

2.5opp D/F基因序列测定与比较结果通过对病原的opp D/F基因的序列分析表明,病原(命名为Gxmboppdf)与国内首次分离的牛支原体HB0801及Hubei-1株同源性为99.3%(图4).

2.6药敏试验结果经48 h培养后观察,病原对氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、左氟沙星、恩诺沙星、林霉素、氯霉素、新霉素、强力霉素、诺氟少星、大观霉素、四环素高敏;对丁胺卡那霉素中敏;对阿奇霉素、红霉素低敏;对头孢拉定、青霉素、头孢曲松、利福平、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑啉、氨苄西林、罗红霉素、多粘菌素、复方新诺明耐药.

2.7其他细菌的分离无菌取病牛肝、肾、肺、淋巴结分别接种TSA琼脂培养基和兔血营养琼脂培养基,37℃培养48 h后未见有菌生长.

图4　广西牛支原体同源性比较及进化树分析

3　讨论

根据发病经过、临床症状、病理变化、病原培养特性、生化试验、PCR鉴定,确诊该病为牛支原体(Mycoplasma bovis)引起的犊牛肺炎,即传染性牛支原体肺炎.自美国人Hale(1961)首次从患乳腺炎的牛奶中分离到该病原,目前已证实牛支原体可引发牛肺炎、乳腺炎,此外,还可导致角膜结膜炎、耳炎、关节炎、生殖道炎症、流产和不孕等多种疾病,已在世界范围内存在.该病在欧洲最为严重,每年约有25%～33%的犊牛肺炎由牛支原体引起,经济损失达1.44亿～1.92亿欧元[4-5].在美国每年由牛支原体引起的牛呼吸系统疾病和乳腺疾病所造成的经济损失也高达1.40亿美元,感染率高达70%[6].2008年,我国部分地区肉牛暴发了以坏死性肺炎为主要特征的犊牛肺炎疫情,辛九庆、石磊、冉智光等证实该疫情是由牛支原体引起的"传染性牛支原体肺炎",疫情波及湖北、河南、山东、东北三省等多个省市自治区,几乎涵盖了中国养牛的主要产区,牛发病率高达50%～ 100%,病死率达10%～50%,给我国的养牛业造成巨大的经济损失[1,7-8].广西是饲养水牛最多的省(区),存栏437万头,奶牛存栏8.77万头,最近几年肉牛产业也蓬勃兴起,引种和流通增多,以肺炎症状为主的病例时有发生,不易治疗,给养殖户造成很大的经济损失.在临床诊断中,牛支原体引起的临床症状和病理剖检变化与牛传染性胸膜肺炎类似,造成诊断上的困难,因此病原分离与鉴定成为最终确诊的重要依据.本实验室在收集到牛肺脏病料时进行了病原的分离和鉴定,结果分离到1株牛支原体.此前,广西未见有牛支原体病的报道,本文首次报道了广西从外地引进的肉牛有该病的存在,但本病在广西的流行情况以及对广西养牛业造成危害程度有待进一步调查.

目前尚无商品化的疫苗对牛支原体病进行预防,临床上宜采取综合性的防治措施.一是加强对牛群的引种检疫,不从疫区引种,引种前应做好牛支原体病、结核、布鲁菌病、泰勒虫病等检测,防止引进病牛或带菌牛.牛群引回后应隔离检疫,确保牛群健康并做必要的预防接种和驱虫后方可混群;二是加强对牛群的饲养管理和消毒工作;三是对发病牛隔离治疗,早发现,早诊断,早治疗是有效控制本病的原则.在用药上宜全群(和病牛接触的牛群)用药,疗程要够,药量要足.药敏试验的结果表明,四环素类、喹诺酮类和泰乐菌素类对牛支原体敏感,但要注意经常变换药物,以免耐药性的产生而使治疗效果不理想.

[1]石磊.牛支原体肺炎病原的鉴定、诊断和疫苗的初步研究[D].武汉:华中农业大学,2010.

[2]李大伟.牛支原体PCR诊断方法的建立及流行病学调查[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2011.

[3]秦若甫,李智红,韦志锋,等.二株绵羊肺炎支原体药物敏感性试验和临床治疗体会[J].广西畜牧兽医,2011,27 (3):165-166.

[4]Nicholas R A J,Ayling R D.Mycoplasma bovis:disease,diag⁃nosis,and control[J].Reasearch in Veterinary Science,2003, 74:105-112.

[5]Hale H H,Helmboldt C F,Plastridge W N,et al.Bovine mastitis caused by Mycoplasma species[J].Comell vet,1962,52:582-591.

[6]Caswell J L,Archambault M.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle[J].Anim Health Res Rev,2008,8(2):161-186.

[7]辛九庆,李媛,郭丹,等.国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体[J].中国预防兽医学报,2008,30(9):661-664.

[8]冉智光,谢建华,骆璐,等.我国部分地区牛支原体肺炎和关节炎的病原体诊断[J].中国预防兽医学报,2010,32(1): 40-43.

S852.65+3文献标志码:B

0529-6005(2016)02-0046-02

2014-02-31

广西畜禽疫苗新技术重点实验室专项(14-045-31-A-6);广西科研基本业务费桂科专项(15-3)

陶立(1964-),男,高级兽医师,本科,从事动物疫病的防制和研究工作,E-mail:gxlitao1223@163.com

陈泽祥,E-mail:xjszexiang@163.com