淫羊藿、巴戟天中药提取物对恒河猴M0、M1型单核衍生巨噬细胞基因表达的影响

成业，　陈颂，　王晓玉，　熊思艺，　符林春

（广州中医药大学热带医学研究所，广东广州　510405）

·中药药理·

淫羊藿、巴戟天中药提取物对恒河猴M0、M1型单核衍生巨噬细胞基因表达的影响

成业，陈颂，王晓玉，熊思艺，符林春

（广州中医药大学热带医学研究所，广东广州510405）

【目的】探讨中药淫羊藿、巴戟天提取物（中药注射液喘可治的组成）对恒河猴单核衍生的巨噬细胞在未极化（M0）、M1极化条件下基因表达的影响，分析其可能的免疫调节的作用机制。【方法】采用密度梯度离心法分离中国恒河猴外周血单个核细胞（PBMCs），采用贴壁法纯化出单核细胞，并以粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激5 d以使单核细胞分化成巨噬细胞；然后不加入极化因子（M0）或以干扰素γ（IFN-γ，继续培养2 d）诱导巨噬细胞极化为M1表型，同时分别加入淫羊藿、巴戟天提取物进行干预；然后提取mRNA并逆转录后，采用实时荧光定量PCR检测CCR5、CD4、CTLA-4、FoxP3、IDO、IL-10、TGF-β等基因表达量。【结果】与空白对照组比较，加入巴戟天提取物培养的M0巨噬细胞基因表达上调不明显；经淫羊藿提取物培养的M0巨噬细胞，CCR5基因表达量上调4.21倍，TGF-β上调7.66倍，FoxP3、IL-10轻度上调，而CD4、CTLA-4、IDO等基因表达改变倍数无明显变化。经巴戟天提取物刺激的M1型巨噬细胞，CTLA-4基因表达量上调3.22倍，FoxP3上调3.69倍，CCR5、CD4、IL-10、IDO基因改变倍数均无明显变化，TGF-β未测出；而由淫羊藿提取物刺激的M1型巨噬细胞，IL-10的表达量上调11.83倍，FoxP3上调4.55倍，IDO、CCR5、CD4、CTLA-4基因改变倍数无明显变化，TGF-β未测出。【结论】巴戟天和淫羊藿提取物培养能够上调M1型巨噬细胞IL-10、FoxP3、CTLA-4等抑炎基因表达，淫羊藿提取物能够上调M0巨噬细胞CCR5和TGF-β等基因表达，促进病原体清除和组织修复，从而发挥多效免疫调节作用。

巨噬细胞；淫羊藿；巴戟天；免疫调节；基因表达调控；恒河猴

喘可治注射液是由中药淫羊藿和巴戟天提取物制成的中药复方制剂，具有温补肾阳、纳气平喘的功效。临床上常用于支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、毛细支气管炎等肺系疾病的治疗。最近也常应用于肺癌［1］、肝癌［2］、艾滋病［3］等疾病的辅助治疗，取得不错的疗效。前期研究［4-7］表明，喘可治具有明显的免疫调节作用，它通过影响T淋巴细胞的活化、增殖和凋亡，Th1/Th2细胞因子分泌平衡，Th17和Treg细胞平衡等多途径影响机体免疫，发挥多效的免疫调节作用。

本实验室前期研究［8］发现，经喘可治治疗后，AIDS猴模型的淋巴结组织的纤维化得到缓解、被破坏的网状结构得到部分修复。从药物疗效的定位和细胞功能来看，推测可能与巨噬细胞密切相关。因此，本研究通过观察喘可治中的淫羊藿、巴戟天的精制提取物对体外培养的单核衍生巨噬细胞基因表达的影响，探讨喘可治改善淋巴结纤维化的作用机理，以及相关免疫调节功能的机制，现报道如下。

1　材料和方法

1.1实验动物健康中国恒河猴4只，均为雄性，体质量（9.57±1.27）kg，饲养于广东莱恩医药研究院有限公司，使用许可证号：SYXK（粤）2015-0146。本实验获得广东省灵长类动物实验中心批准（文件编号：K09004-IACUC）。

1.2主要仪器和试剂ABI 7500型荧光定量PCR仪器（美国Applied Biosystems公司）；ABI 2720型PCR扩增仪（美国Applied Biosystems公司）；L-550型台式低速大容量离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；MIKRO 200R高速低温离心机（德国Hettich公司）；HealForce HF90型二氧化碳培养箱（香港力康生物医疗科技控股集团）。喘可治主要成分淫羊藿和巴戟天药物提取物（主要成分分别为淫羊藿苷和巴戟天总黄酮）由广州万正药业有限公司提供（批号：14102902）；重组蛋白干扰素γ（IFN-γ，美国Peprotech公司）；重组蛋白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（吉姆欣，华北制药金坦生物技术股份有限公司）；M-MLV反转录酶（美国Invitrogen公司）；RNase OUT重组核酸酶抑制剂（美国Invitrogen公司）；SYBR Select Master Mix（美国Applied Biosystems公司）；Trizol Reagent（美国Invitrogen公司）；淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；本研究所用的qPCR引物引用自Hryniewicz［9］和Malnati［10］的文献，详见表1。

1.3密度梯度离心法分离外周血单个核细胞群（PBMCs）采集乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝猴血10 mL，用磷酸盐缓冲液（PBS）1∶1稀释，然后将稀释血液缓慢倒至淋巴细胞分离液上层，使稀释血液和淋巴细胞分离液保持明显分界；淋巴细胞分离液和原血体积比为1∶1，550×g离心22 min。离心后吸出云雾状PBMCs层，用20 mL PBS清洗细胞2次，每次300×g离心12 min。

1.4细胞培养及分组收获细胞，用含体积分数10%胎牛血清培养基重悬细胞，将细胞于24孔培养板中培养，以每孔2.5×106的细胞数于37℃、体积分数5%CO2培养1 h，待巨噬细胞贴壁后，用PBS洗去未贴壁细胞，加入含1.5 mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的培养液于37℃、体积分数5%CO2培养5 d分化成M0型巨噬细胞。将细胞分为空白对照组、淫羊藿组和巴戟天组。空白对照组加入1 mL完全培养基继续培养2 d，淫羊藿组和巴戟天组分别加入1 mL含淫羊藿提取物、巴戟天提取物的培养液培养M0型巨噬细胞2 d；或加入含1 mL IFN-γ培养2 d诱导分化成M1型巨噬细胞。其中空白对照组不加药，淫羊藿组和巴戟天组分别加入淫羊藿提取物、巴戟天提取物与IFN-γ共同培养。使加入药物的终浓度分别为GM-CSF 20 ng/mL、IFN-γ 10 ng/mL、淫羊藿提取物2 μg/ mL、巴戟天提取物2 μg/mL。

表1　各基因qPCR引物序列Table 1　Primer sequence of various genes for qPCR

1.5提取总RNA提取方法参照Trizol试剂说明书。每个培养孔加入100 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）水，500 μL Trizol，充分吹打数次；吸取混合液至1.5 mL离心管中，室温孵育5 min，加入100 μL三氯甲烷，剧烈震荡15 s，室温静置2～3 min，12 000×g、4℃离心15 min；吸取上层无色溶液至新的1.5 mL离心管，加入250 μL体积分数100%异丙醇，上下颠倒数次；室温静置10 min，12 000 ×g、4℃离心10 min，倾去上清，加入500 μL体积分数75%乙醇，短暂涡旋；再以7 500×g、4℃离心5 min，弃上清，干燥RNA小团5～10 min。加DEPC水稀释。

1.6逆转录cDNA逆转录参照莫洛尼氏鼠白血病毒逆转录酶（M-MLV RT）说明书。每1 ng～5 μg 总RNA加入1 μL随机引物（50 ng/μL），1μL 10 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）混合物，补入DEPC水至12 μL。混合后于65℃加热5 min，然后迅速置于冰上，短暂离心后加入 2 μL 10×RT Buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL 0.1 mmol/L二硫代苏糖醇（DTT），1 μL RNase OUT核酸酶抑制剂，将各组分轻轻混匀，于37℃孵育2 min；然后加入1 μL M-MLV逆转录酶，轻轻吹打充分混匀，然后于PCR仪上25℃、10 min，37℃、50 min，70℃、15 min完成逆转录。

1.7实时荧光定量PCR以cDNA为模板扩增CCR5、CD4、CTLA-4、FoxP3、 IDO、IL-10、TGF-β、GAPDH基因编码片段，每5 μL cDNA模板加入12.5 μL SYBR Select Master Mix，0.5 μL 20 nmol/L上游引物，0.5 μL 20 nmol/L下游引物，补充DEPC水至25 μL。PCR反应条件如下：50℃、2 min，95℃、10 min预变性；95℃变性15 s，60℃延伸1 min，40个循环。

1.8统计方法数据来自于3次独立实验，以GAPDH为内参基因，以空白组为对照组，ABI 7500 software V2.0.6软件自动分析得出荧光阈值循环数（Ct值），计算2-ΔΔCt为所得改变倍数，并以均数±标准误（±SE）表示。采用SPSS17.0统计软件进行数据统计分析。满足正态分布的数据资料采用One-Way ANOVA检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并且改变倍数＞2为有影响［11］。

2　结果

2.1巴戟天和淫羊藿提取物对M0巨噬细胞基因表达的影响表2结果显示：与空白对照组比较，巴戟天提取物组M0巨噬细胞CCR5、CTLA-4、FoxP3、IDO、IL-10、TGF-β基因表达显著升高（P＜0.05），但改变倍数不显著。而淫羊藿提取物刺激M0巨噬细胞后，CCR5基因显著增加4.21倍（P＜0.01）、TGF-β基因显著增加7.66倍（P＜0.01），并能够上调 IL-10、FoxP3的表达（P＜0.01），CTLA-4基因与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），但对改变倍数无显著影响。

2.2巴戟天和淫羊藿提取物对M1巨噬细胞基因表达的影响表3结果显示：与空白对照组比较，经巴戟天提取物刺激的M1型巨噬细胞CTLA-4基因增加3.22倍（P＜0.01），FoxP3基因增加3.69倍（P＜0.01），CCR5、CD4、IDO基因改变差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），但改变倍数无明显变化，TGF-β基因未测出。而由淫羊藿提取物刺激的M1型巨噬细胞IL-10基因显著增加11.83倍（P＜0.01），FoxP3基因显著增加4.55倍（P＜0.01），IDO、CCR5、CD4、CTLA-4基因改变差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），但改变倍数无显著变化，TGF-β基因未测出。

表2　各组M0巨噬细胞炎症基因表达的比较Table 2　Comparison of inflammatory gene expression levels of M0 macrophages in rhesus monkeys of different groups　（±SE，n2-ΔΔCt）

表2　各组M0巨噬细胞炎症基因表达的比较Table 2　Comparison of inflammatory gene expression levels of M0 macrophages in rhesus monkeys of different groups　（±SE，n2-ΔΔCt）

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白对照组比较

表3　各组M1型巨噬细胞炎症基因表达的比较Table 3　Comparison of inflammatory gene expression levels of M1 macrophages in rhesus monkeys of different groups　（±SE，n2-ΔΔCt）

表3　各组M1型巨噬细胞炎症基因表达的比较Table 3　Comparison of inflammatory gene expression levels of M1 macrophages in rhesus monkeys of different groups　（±SE，n2-ΔΔCt）

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白对照组比较

组别空白对照组巴戟天组淫羊藿组N 3 3 3 CCR5 1±0 0.57±0.22①0.54±0.21①CD4 1±0 0.27±0.16②0.39±0.13②CTLA-4 1±0 3.22±0.40②1.33±0.20①FoxP3 1±0 3.69±0.22②4.55±0.66②IDO 1±0 0.37±0.18②1.70±0.23②IL-10 1±0 1.03±0.21 11.83±0.86②TGF-β ---

3　讨论

巨噬细胞在炎症、组织损伤和修复过程中有重要的作用。并且不同极化状态的巨噬细胞的作用有很大的区别。某些类型巨噬细胞能够分泌转化生长因子（TGF）β1、血小板衍生因子（PDGF）等细胞因子促进组织修复的过程，而某些类型巨噬细胞可产生白细胞介素-10（IL-10）、抵抗素样分子（RELM）α和精氨酸酶（ARG）1，减轻组织损害，改善组织纤维化。

M1型巨噬细胞在体外特征性表达为 IL-12hiIL-23hiIL-10lo表型，其能高效分泌毒性效应分子（ROS和NO）和促炎细胞因子（IL-1β、TNF、IL-6），作为诱导物或效应细胞参与Th1应答；同时还介导对细胞内寄生虫和肿瘤的抑制作用［12］。M1型巨噬细胞是典型的促炎症细胞，在组织修复过程中，M1型巨噬细胞能够释放金属蛋白酶（MMPs）如MMP2和MMP9有助于降解细胞外基质（ECM），促进炎症细胞募集至受损的组织处；如果受损的组织持续受到刺激，激活的M1型巨噬细胞进一步募集大量的Th17细胞和嗜中性粒细胞至受损组织，加剧炎症应答，导致大量的组织损伤。因此，在组织细胞损伤修复的过程中，M1型巨噬细胞可以促进炎症反应，加重损伤组织部位的炎症应答，导致组织损伤，从而不利于组织修复［13］。

本研究结果显示：经淫羊藿提取物培养的M1型巨噬细胞，IL-10基因呈现高表达量，与空白对照组比较增加11倍以上。IL-10是一个大小约35 kDa同型二聚体细胞因子，它可以由T细胞、单核细胞、巨噬细胞等多种细胞产生。IL-10最初被描述为一个细胞因子合成抑制因子，是因为其能极大地激活巨噬细胞/单核细胞，同时能减少促炎细胞因子的产生［14-15］。然而，IL-10除了强效抗炎症作用，还表现出调节致纤维细胞因子的分泌，如TGF-β等［16］。有研究［17］表明，在小鼠切开伤口中，IL-10的高表达能够减少疤痕组织的形成。而另一项研究［18］表明，在增生瘢痕组织中，IL-10的浓度增加，能够表现出一种新的抗纤维化机制，其能促进蛋白激酶B（AKT）和信号传导及转录激活因子3 （STAT3）联合激活信号转换通路之间的交联，从而阻碍纤维化相关基因的表达和过多ECM成分的蓄积。因此，淫羊藿通过上调IL-10的表达，从而抑制组织纤维化。

另外，本研究发现，巴戟天提取物和淫羊藿提取物能够上调M1型巨噬细胞叉头样转录因子3（FoxP3）的表达。调节性T细胞（Treg）是人体必要的免疫调节细胞，能负调控免疫应答，维持对自身的免疫耐受和抑制自身免疫性疾病的发生。Treg细胞能够通过抑制T细胞的活化和增殖、抑制IL-2和其他细胞因子在效应T细胞的表达、分泌抑制性细胞因子、负调控抗原提呈细胞、裂解效应T细胞和抗原提呈细胞等途径发挥免疫失能和免疫抑制的功能。FoxP3对Treg细胞在胸腺的正常生长和发育中具有重要作用，同时是维持Treg细胞功能的重要转录因子［19］。因此，巴戟天提取物和淫羊藿提取物可能通过上调FoxP3基因的表达，发挥免疫耐受作用。

本研究还发现巴戟天提取物能够上调M1巨噬细胞的细胞毒性T细胞相关淋巴抗原-4（CTLA-4）的表达。CTLA-4与CD28是调控T细胞激活的两个作用相反的共刺激信号分子［20］，CD28是激活T细胞的共刺激分子，而CTLA-4对T细胞的激活有反馈调节的作用。CTLA-4和CD28两者结构相似，它们有共同的配体B7（CD80和CD86）［21］。但是，CTLA-4与B7的亲和力比CD28分子高［22］，CTLA-4能竞争性地与抗原提呈细胞B7分子结合，从而抑制T细胞的激活，发挥免疫抑制作用。因此，巴戟天提取物能够通过影响M1巨噬细胞CTLA-4的表达，发挥免疫抑制的功能。

淫羊藿提取物培养M0型巨噬细胞后能上调其CCR5和TGF-β的基因表达。CCR5是趋化因子受体家族的一员，为7次跨膜的G-蛋白偶联受体，其是HIV-1感染免疫细胞的重要辅助受体。此外，CCR5还可以介导单核巨噬细胞和自然杀伤细胞的募集［23-24］，以及影响IL-2和活化T细胞核因子（NFAT）的表达，继而进一步影响STAT5和CD25的磷酸化过程和T细胞的增殖［25］，从而促进病原体清除的发生。TGF-β是组织创伤修复中重要的调控细胞因子，TGF-β能够通过促进纤维原细胞分化成成肌纤维细胞，同时增加组织金属蛋白酶移植物的表达，阻止细胞外基质（ECM）的降解，并通过直接刺激成肌纤维细胞中的间质纤维蛋白合成体，加速组织修复，减轻炎症反应［26-27］。本研究结果显示：淫羊藿提取物对M0巨噬细胞CCR5和TGF-β基因有促进表达的作用，使M0型巨噬细胞表现出一种促进病原体清除和组织修复的作用。

当巴戟天和淫羊藿提取物分别与IFN-γ共同刺激M0型巨噬细胞向M1型极化时，TGF-β并未测出，这与M1型巨噬细胞低分泌TGF-β相符合［28］。

M1型巨噬细胞是一类常见的炎症性巨噬细胞，能够促进机体的炎性免疫应答。经巴戟天和淫羊藿提取物培养后，M1型巨噬细胞能上调IL-10、FoxP3、CTLA-4等抑炎基因表达，发挥免疫抑制作用，有利于组织结构的维持和保护。而经淫羊藿提取物培养的M0型巨噬细胞，则能够上调CCR5 和TGF-β的基因表达，呈现出促进病原体清除和组织修复的作用。总结本研究的结果，巴戟天和淫羊藿提取物通过对巨噬细胞M0和M1型基因表达影响的不同，发挥不同的免疫调节作用。

（致谢：广州万正药业有限公司惠赠供研究使用的“喘可治”注射液的单一药物提取物；本研究的检测分析在广州中医药大学省“211工程”建设项目、广州中医药大学中医临床基础国家重点学科实验室完成。感谢邓文娣、赖春辉、于靓、周映云、秦小平老师提供的技术帮助！）

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【责任编辑：黄玲】

Influence of Extracts from Herba Epimedii and Radix Morindae Officinalis on Gene Expression of M0 and M1 Type Monocyte-derived Macrophages in Rhesus Monkeys

CHENG Ye，CHEN Song，WANG Xiaoyu，XIONG Siyi，FU Linchun
（Institute of Tropical Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo study the influence of the extracts fromHerba Epimedii（Yinyanghuo）and Radix Morindae Officinalis（Bajitian），the main ingredients of Chinese herbal injection Chuankezhi，on the gene expression of unpolarized（M0）and polarized（M1）monocyte-derived macrophages in rhesus monkeys，and to analyze the immunoregulatory mechanisms.Methods Peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）in rhesus monkeys were isolated by density-gradient centrifugation method，and were purified by adherent culture method.The purified mononuclear cells were induced to differentiate into M0 macrophages following stimulation with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（GM-CSF）for 5 days，and then the M0 macrophages were induced into M1 macrophages without polarization factor added or with IFN-γ added for 2 days.After M1 macrophages were treated with the extracts from Yinyanghuo or Bajitian，the total mRNA was extracted and then was used for reverse transcription to cDNA.The gene expression of CCR5， CD4， CTLA-4， FoxP3，IDO，interleukine（IL）-10 and transforming growth factor（TGF）-β was measured by real-time polymerase chain reaction（PCR）.Results Compared with the blank control group，the gene expression of M0 macrophagescultured with Bajitian extract showed no obvious change，while the gene expression of CCR5 in M0 macrophages cultured with Yinyanghuo extract was up-regulated by 4.21 folds， TGF-β was up-regulated by 7.66 folds，FoxP3 and IL-10 were up-regulated mildly，and no obvious changes were shown in the up-regulation folds of CD4，CTLA-4 or IDO.The gene expression of CTLA-4 in M1 macrophages cultured with Bajitian extract was up-regulated by 3.22 folds，FoxP3 was up-regulated by 3.69 folds，no obvious changes were shown in the upregulation folds of CCR5，CD4，IL-10 or IDO，and TGF-β was undetectable.In M1 macrophage treated with Yinyanghuo extract，IL-10 gene expression was up-regulated by 11.83 folds，FoxP3 was up-regulated by 4.55 folds，no obvious changes were shown in the up-regulation folds of IDO，CCR5，CD4 or CTLA-4，and TGF-β was also undetectable.Conclusion The extracts from Bajitian and Yinyanghuo can up-regulate the antiinflammatory genes，FoxP3 IL-10 and CTLA-4 in M1 macrophages；Yinyanghuo extract can up-regulate CCR5 and TGF-β gene expression of M0 macrophages，and promote pathogen clearance and tissue repair，so as to achieve multiple-effect immunological regulation.

macrophages；Herba Epimedii（Yinyanghuo）；Radix Morindae officinalis（Bajitian）；immune regulation；gene expression regulation；rhesus monkeys

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0520-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.019

2016-03-01

成业（1989-），男，硕士研究生；E-mail：cy890913@sina.com

符林春（1957-），男，研究员；E-mail：fulc01@126.com；陈颂（1977-），男，助理研究员；E-mail：chensong@gzucm.edu.com

国家科技重大专项资助项目（编号：2014ZX10005002）