基于代谢组学技术的田黄方配伍机制分析

罗朵生，　李坤平，　荣向路，　郭姣

（1.广东省代谢病中西医结合研究中心，广东药科大学，广东广州　510006；2.广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室，广东广州　510006）

基于代谢组学技术的田黄方配伍机制分析

罗朵生1，2，李坤平1，荣向路1，2，郭姣1，2

（1.广东省代谢病中西医结合研究中心，广东药科大学，广东广州510006；2.广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室，广东广州510006）

【目的】观察田黄方不同组方对血脂及代谢产物的影响，揭示其治疗高脂血症的组方机制。【方法】取雄性SD大鼠30只，分为正常组、模型组、三七组、黄连组及田黄组。采用高脂乳剂灌胃法复制高脂血症大鼠模型并给予相应药物治疗，采集治疗4周后的血液，采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用（UPLC/Q-TOF MS）技术建立大鼠血清的代谢物指纹图谱。应用主成分分析和偏最小二乘判别分析模型组和田黄组、三七组、黄连组之间的代谢物谱差异，并通过变量重要性投影（VIP）选取生物标志物，比较各组的标志物并找出差异。【结果】田黄方对饮食性高脂血症大鼠模型的干预作用主要体现在对脂肪代谢、氨基酸代谢、炎症和氧化应激的调节作用，而三七、黄连虽能一定程度改善模型组大鼠的代谢紊乱状态，但未能从根本上恢复。【结论】田黄方对高脂血症动物模型血脂及代谢产物的调节作用优于三七、黄连单用，其中三七以调节氨基酸代谢、能量代谢为主，黄连以调节炎症、氧化应激及能量代谢为主，田黄方对上述代谢紊乱均有调节作用。

田黄方；高脂血症/中药疗法；代谢组学；疾病模型，动物；大鼠

代谢组学方法主要用于研究生物体内所有代谢产物在疾病或外源性物质等因素扰动下的动态变化，并以此来反映生物体的病理生理变化趋势，进而揭示其变化的机制［1］。代谢组学的研究思想是将人与外界环境的相互影响加以综合考虑，该思想与传统中医药强调人与自然协调统一的整体观及其诊疗模式吻合。利用代谢组学方法可以更好地阐释中药组方的合理性、中医诊断的科学性等。

田黄方是广东药科大学郭姣教授临床验方，由三七、黄连组成，课题组前期研究表明：该方具有降低高脂血症大鼠血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）作用，防治脂肪肝，还能减少apoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块。方中三七、黄连是临床常用药物，具有多种药理作用。如现代药理学研究表明三七具有改善心肌缺血、抗血小板聚集、降压、抗动脉粥样硬化等作用。近年来三七常用于治疗冠心病、糖尿病、抗血栓等［2］。黄连主要活性成分小檗碱不仅在抗菌消炎、抗肠道细菌感染等传统药效方面发挥作用，而且在心血管系统疾病治疗、高脂血症及癌症等方面的治疗也表现出较好的生物活性，具有潜在的广泛应用价值［3］。但据文献报道，其单用口服时两者生物利用度均不高［4-5］。本课题组前期药代动力学研究表明：三七配伍黄连后，可促进三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的吸收，提高其体内生物利用度。据此，本研究拟在比较该方单用及合用降脂药效的基础上，进一步从代谢组学角度，探讨该方单用和合用降低高脂血症的作用机制，为其组方的合理性及进一步开发利用提供实验依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1试验药物

黄连，为毛茛科植物黄连 Coptischinensis Franch的干燥根茎；三七，为五加科植物三七Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen的干燥根和根茎，购自广州至信药业有限公司（生产批号分别为050101、050322），经广东药学院何伟教授鉴定，符合《中华人民共和国药典》（2015年版）项下标准。取黄连、三七一定量，精密称定，置于圆底烧瓶中，第1次加8倍量70%（体积分数，下同）乙醇，第2次分别加6倍70%乙醇，沸腾后计时，每次1 h，合并2次醇提液，减压回收乙醇浓缩，制成质量比黄连∶三七为1∶0、黄连∶三七为0∶1和黄连∶三七为1∶1的3个配比溶液，终浓度以生药含量计1 g/mL，放4℃保存备用。

1.2动物

SD大鼠30只，雄性，体质量约120 g，SPF级，广东省医学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SCXK（粤）2008-0002。大鼠饲养在SPF洁净级别动物房，室温为22℃～24℃，相对湿度在40%～60%，光照时间随自然变化，自由饮食饮水。

1.3试剂

脱氧胆酸钠和胆固醇（中国医药集团公司）；丙硫氧嘧啶（广东华南药业公司）；吐温280、1，2-丙二醇均为国产分析纯试剂；总胆固醇（CHO）试剂盒、甘油三酯（TG）试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒，均购自中生北控生物科技股份有限公司。乙腈、异丙醇、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯，主要包括：无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂）；正己烷（天津市大茂化学试剂厂）；丙酮（衡阳市凯信化工试剂有限公司）；水为自制超纯水。

1.4仪器

超高效液相色谱—四级杆飞行时间质谱联用仪（UPLC/Q-TOF MS，美国Waters公司）；GT10-1型高速台式冷冻离心机（美国Fisher公司）；AMS-18A全自动生化仪（北京北方奥普森科技发展有限公司）。

1.5高脂血症大鼠模型的建立及动物分组

采用高脂乳剂灌胃法复制高脂血症大鼠动物模型，高脂乳剂参考课题组文献［6］方法配制：称取25 g猪油置200 mL烧杯中，加热到100℃左右使其溶解，缓慢加入10 g胆固醇，搅拌至完全溶解；再加入1 g丙硫氧嘧啶和25 mL吐温280，充分搅匀。同时在另一烧杯中加入30 mL蒸馏水和1，2丙二醇20 mL，加热至60℃，然后加入2 g脱氧胆酸钠，充分搅拌直到完全溶解。然后将2种溶液充分混匀，制成脂肪乳剂。大鼠适应性饲养7 d后，采用随机数字表法分为正常组、模型组、田黄组、三七组和黄连组，每组6只。正常组给予生理盐水，模型组灌胃给予高脂乳剂，连续给药4周诱导高脂血症模型后分别给予相应药物干预4周，给药剂量均为3 g/kg。

1.6检测指标及方法

给药4周，眼眶后静脉丛取血，一部分加入肝素钠抗凝管中，于-80℃冰箱中保存备用于代谢组学分析；剩余部分离心（3 000 r/min，10 min），制备血清，采用生化分析仪检测血脂4项（TC、TG、LDL-C以及HDL-C）。

1.7UPLC/Q-TOF MS测定

1.7.1样品制备取出血清，常温解冻，离心（8 000 r/min，10 min），取400 μL上清液，氮气吹干，加入200 μL乙腈—水（体积比为10∶90）复溶，取上清液100 μL进样。

1.7.2色谱条件采用Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色谱柱；柱温 40℃，样品室温度：4℃，流速 0.35 mL/min，进样量5 μL；流动相体积分数为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，0～5%B；10～11 min，30% ～50%B；11～16.5 min，50% ～100%B；16.5～17.5 min，100%～5%B；17.5～19 min，95%B）。

1.7.3数据采集电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）离子源，在正、负离子模式下，扫描范围质荷比（m/z）100～1 000。毛细管电压3.0 kV，锥孔电压35 kV，离子源温度100℃，脱溶剂温度为450℃，脱溶剂气体流速900 L/h，锥孔气流量50 L/h。

1.8统计方法

采用Mass Lynx V 4.1工作站对检测所得的总离子流图进行色谱峰识别、峰匹配，峰面积积分。将每个数据点转换成精确质量和保留时间数据对，并以二维矩阵的形式将结果列出。利用主成分分析法（PCA）对数据进行处理，之后采用偏最小二乘模式识别分析法（PLS-DA）进行组间数据分析，选取模型中对分型贡献比较大的变量也即变量重要性因子（variable importance in projection，VIP）≥1.5，将这些变量作为候选标志物，得到其保留时间和质荷比信息。

1.9生物标记物的鉴定

根据化合物的精确分子量查询以下3个在线数据库：KEGG（http：//www.keg.com）、METLIN（http：//www.metlin.scipps.edu）、HMDB（http：//www.Hmdb. ca），解析化合物质谱，对化合物进行结构鉴定。因目前UPLC-TOF MS尚无公认的统一代谢组学数据库，本研究中对数据库检索的结果进行质荷比（m/z）和保留时间（retention time，tR）的匹配对照，对于质荷比在±0.5的，质谱保留时间波动范围为±0.5 min，在线性增加容许范围内的波动视为同一种物质。因部分内源性标志物质荷比和保留时间相近或者是质量数呈规律性变化（如+H、+Na、-H等），视为同一物质的不同碎片，基于Metlab进行了各峰的相关性检验，相关系数≥0.95的峰视为同一物质，能更好地对这些质荷比和保留时间相近的内源性标志物进行解释。代谢途径的查找将潜在代谢标记物输入KEGG数据库，进一步发现代谢物涉及的代谢途径。

2　结果

2.1田黄方配伍对高脂血症大鼠血脂的影响

表1结果表明：模型组TC、TG、LDL-C含量显著升高，HDL-C含量显著降低，与正常组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；三七组、黄连组和田黄组均可显著降低TC、TG、LDL-C含量，与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），其中田黄组作用更明显。

表1　各组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量比较Table 1　Comparison of rat serum TC，TG，LDL-C and HDL-C contents in various groups［±s，c/（mmol·L-1）］

表1　各组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量比较Table 1　Comparison of rat serum TC，TG，LDL-C and HDL-C contents in various groups［±s，c/（mmol·L-1）］

①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.01；与模型组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与田黄组比较

组别正常组模型组三七组黄连组田黄组N 6 6 6 6 6 TC 2.55±0.34 10.02±0.84①3.69±0.63②④2.74±0.65②2.58±0.22②TG 0.71±0.18 2.48±0.12①1.28±0.26②③1.35±0.21②③0.91±0.17②LDL-C 6.45±1.02 10.39±1.55①7.19±0.83②7.07±0.79②6.42±0.58②HDL-C 1.47±0.22 0.45±0.07①0.54±0.24 0.52±0.09 0.57±0.17

2.2田黄配伍降低高脂血症大鼠血脂机制的探讨

2.2.1大鼠血清UPLC/Q-TOF MS代谢物谱分析良好的色谱分析效果是保证信号不损失的关键，也是保证后期数据处理结果可信性的基础。图1结果显示：在优化后的分析条件下，应用此条件正离子模式下取得了良好的分析效果。

图1　大鼠血清正离子模式下的UPLC/Q-TOF MS轮廓谱Figure 1　UPLC/Q-TOF MS results for various groups

2.2.2各给药组所致高脂血症大鼠代谢表型的变化先运用 PCA法分析，观察模型组与正常组、各给药组与模型组的血清代谢物的差异。从图2中可以看出，正常组与模型组完全分开，说明在造模过程中，大鼠机体生理及物质代谢状况发生了明显变化，而各给药组与模型组可以明显的区分开来，说明在给药治疗过程中，能调节大鼠的机体病理及物质代谢状况。从PLS-DA轨迹图（图3）可以看出，转归趋势为模型组→三七组→黄连组→田黄组→正常组，其中田黄组与正常组在PCI维接近，说明田黄方通过干预高脂血症模型大鼠内源性代谢产物，使之代谢紊乱恢复至接近正常组。PCA loading图可以找出对样本的分类具有重要贡献的代谢物的信息，离原点越远的成分对分类贡献越大，这些成分可分别被认为是干扰正常生理代谢（图4）及发挥药效作用机制（图5）的潜在生物标记物。

图2　大鼠正常组、模型组血清样品Scores plots Figure 2 Scores plots of serum samples in the normal group and the model group

图3　各组PCA轨迹图Figure 3　PCA trace of various groups

图4　大鼠正常组、模型组血清样品loadingFigure 4　Loading chart of serum samples in the normal group and the model group

图5　高脂血症大鼠不同给药组loadingFigure 5　Loading chart of hyperlipidemia rats in various medication groups

2.2.3田黄方配伍作用机制的探讨根据PLSDA分析中VIP值和PCA分析中的重要性，筛选各组中具有明显差异的化合物，结果在各组中找到了21个具有显著差异的化合物。然后，根据所得到的分子式进行数据库检索。检索策略如下：首先通过一级质谱测得其准确的质荷比，提取其总离子流图，确定该质荷比离子最大响应的保留时间，提取该保留时间的质谱图。根据一级质谱图的同位素峰信息，使用软件中Formula Finder功能计算元素组成，结果显示由质量偏差最小的元素组成。利用软件中的IDA explore功能，获得该质量数的二级质谱，根据化合物元素组成和二级碎片离子，利用Chemspider Service对HMDB、METLIN、KEGG数据库进行搜索，结合化合物化学键断裂规律对化合物结构进行判断，最终鉴定化合物，对于质荷比在±0.5的，质谱保留时间波动范围为±0.5 min，在线性增加容许范围内的波动视为同一种物质。鉴定结果见表2、表3。

表2、表3结果提示：三七、黄连、田黄方各实验组对生物标志物干预的数量分别为13、16、21个。从对生物标示物干预的数量来评价，田黄方＞黄连＞三七，以对生物标志物的干预作用来排序，药理作用从强到弱依次为田黄方、黄连、三七，与药效结果及得分图的结果基本一致。

表2　高脂血症动物模型表达上调趋势的生物标志物及各实验组对其干预作用的对比分析Table 2　Comparison of up-regulated biomarkers of rats in various groups

3　讨论

整体综合调节是中药复方作用的主要方式。本研究采用代谢组学的全局观方法，通过比较田黄方组合及拆方调节高脂血症动物模型血脂的药效作用，并进一步分析所有代谢产物的整体变化，综合评价田黄方及其拆方的作用效果及配伍规律，结果显示：田黄方对TC、TG、LDL-C的调节作用优于黄连组、三七组。以各实验组对高脂血症动物模型的整体代谢和内源性生物标志物的干预变化为评价指标，田黄全方作用最好，黄连、三七次之。

表3　高脂血症动物模型表达下调趋势的生物标志物及各实验组对其干预作用的对比分析Table 3　Comparison of down-regulated biomarkers of rats in various groups

通过比较分析正常组与模型组潜在生物标志物发现，高脂血症大鼠不仅出现了脂质代谢紊乱，而且还伴随着糖代谢、氨基酸代谢的紊乱以及炎症和氧化应激的出现。而通过比较各给药组与模型组发现，不同给药组调节代谢紊乱作用特点和机制不同，其中三七主要通过调节高脂血症大鼠氨基酸、能量代谢紊乱而发挥作用，表现在影响3-羟基丁酸、甲硫氨酸，赖氨酸、甘氨酸、缬氨酸等，这些小分子代谢物与能量代谢、氨基酸代谢密切相关，如3-羟基丁酸水平的升高表明脂肪酸氧化的增强［7］，柠檬酸、乌头酸是三羧酸循环的中间产物［8］。黄连主要通过调节炎症、氧化应激及能量代谢发挥作用，表现在主要影响谷氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、N-乙酰糖蛋白等。如谷氨酸和谷氨酰胺是体内重要抗氧化剂谷胱甘肽和牛磺酸的前体，是代谢疾病发生过程中的重要氨基酸，其含量的下降表明高脂血症中氧化应激的发生［9］。N-乙酰糖蛋白是炎症标记物和急性期反应物蛋白，其水平的增高提示在高脂血症发展过程中炎症的发生［10］；田黄方组合对上述代谢紊乱的调节作用强于单方组，进一步说明了该组方的合理性。

［1］黄晓晨，宿树兰，郭建明，等.代谢组学在中医药若干科学问题研究中的应用与思考［J］.中草药，2014，45（2）：147.

［2］王莹，禇扬，李伟，等.三七中皂苷成分及其药理作用的研究进展［J］.中草药，2015，46（9）：1381.

［3］王利红，唐文照，辛义周.黄连中生物碱成分及药理作用研究进展［J］.山东中医药大学学报，2015，39（4）：389.

［4］Li X Y，Hao H P，Wang G J，et al.Integrated pharmacokinetic study of multiple effective components contained in total Panax notoginsenoside［J］.Chin Nat Med，2008，6（5）：377．

［5］盛美萍，孙淇，王宏.盐酸小檗碱在Beagle狗静脉注射和口服药动学研究［J］.中国药理学通报，1993，9（1）：64

［6］郭姣，贝伟剑，唐春萍.复方贞术调脂方对饮食性高脂血症大鼠肝脂酶的作用［J］.中药材，2009，32（4）：582.

［7］Jiang C Y，Yang K M，Yang L，et al.A 1H NMR-based metabonomic investigation of time-related metabolic trajectories of the plasma，urine and liver extracts of hyperlipidemic hamsters ［J］.PLoS One，2013，8（6）：e66786.

［8］Zhao X，Fritsche J，Wang J，et al.Metabonomic fingerprints of fasting plasma and spot urine reveal human pre-diabetic metabolic traits［J］.Metabolomics，2010，6（3）：362.

［9］Brocker C，Thompson D C，Vasiliou V.The role of hyperosmotic stress in inflammation and disease［J］.Biomol Concepts，2012，3（4）：345.

［10］Oakes N D，Kjellstedt A，Thalén P，et al.Roles of fatty acid oversupply and impaired oxidation in lipid accumulationin tissues of obese rats［J］.J Lipids， 2013，2013：420754.

【责任编辑：黄玲】

Analysis of Compatibility Mechanism of Tianhuang Fang Based on
Metabonomics

LUO Duosheng1，2，LI Kunping1，RONG Xianglu1，2，GUO Jiao1，2

（1.Guangdong Metabolic Diseases Research Center of Integrated Chinese and Western Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.Guangdong TCM Key Laboratory for Metabolic Diseases，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo study the effects of Tianhuang Fang，a prescription composed of Radix Notoginseng （Sanqi）and Rhizoma Coptidis（Huanglian），and its separated prescriptions on blood lipids and metabolic products，and to explore the compatibility rule of Tianhuang Fang in treating hyperlipidemia.Methods Thirty male SD rats were randomly divided into 5 groups，namely normal group，model group，Sanqi group，Huanglian group，and Tianhuang Fang group.Rat model of hyperlipidemia was established by intragastric administration of high-fat emulsion， and then the modeled rats were given corresponding medication respectively.After treatment for 4 weeks，serum samples were collected for the establishment of metabolism fingerprint by ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLC/QTOF MS）.The differences of metabolism fingerprint in the above groups were studied by principal component analysis（PCA）and partial least squares-discriminant analysis（PLS-DA），and then biomarkers were screened by variable importance in the projection（VIP）and compared in various groups.Results Tianhuang Fang had an effect on regulating the fat metabolism，amino acid metabolism，inflammation，andoxidative stress of dietinduced hyperlipidemia rats，while Tianqi and Huanglian only improved some aspects of metabolic disorders to a certain degree.Conclusion Tianhuang Fang has better effect on the regulation of blood lipids and metabolites than Sanqi and Huanglian.Sanqi mainly regulates amino acid and energy metabolism，Huanglian plays a role in regulating inflammation，oxidative stress and energy metabolism，while Tianhuang Fang has an overall effect on the above metabolic disorders.

Tianhuang Fang；hyperlipidemia/TCD therapy；metabonomics；disease models，animal；rats

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0525-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.020

2016-02-29

罗朵生（1983-），女，助理研究员；E-mail：lds0901@163.com

郭姣，女，教授；E-mail：gyguoyz@163.com

国家自然科学基金青年项目（编号：81503313）；广州市科技计划项目（编号：1563000412）