血必净注射液对创伤后内皮细胞合成血管生成素2及血管内皮钙黏蛋白的影响

汤建勇，　张海晖，　李天生，　何惠娟，　张媛莉

（1.广东医学院附属医院重症医学科，广东湛江　524000；2.广东医学院附属医院临床医学研究中心，广东湛江　524000）

血必净注射液对创伤后内皮细胞合成血管生成素2及血管内皮钙黏蛋白的影响

汤建勇1，张海晖1，李天生1，何惠娟2，张媛莉1

（1.广东医学院附属医院重症医学科，广东湛江524000；2.广东医学院附属医院临床医学研究中心，广东湛江524000）

【目的】观察细胞外热休克蛋白70（eHSP70）模拟创伤刺激内皮细胞后血管生成素2（Ang-2）及血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）的变化，探讨血必净注射液对血管内皮的保护作用。【方法】培养人脐静脉内皮细胞，检测eHSP70刺激0、2、4、8、16、32 h后细胞Ang-2、VE-cadherin的mRNA和蛋白表达量，找出最佳刺激时间，然后设空白对照组、eHSP70组（终浓度为0.1 μg/mL）、血必净组（终浓度为50 mg/mL）、血必净+eHSP70组共4个实验组，检测最佳时间点各组上述指标改变。【结果】 eHSP70刺激后Ang-2的mRNA及蛋白表达量增加并于4 h达到高峰，而VE-cadherin的mRNA和蛋白表达量经eHSP70刺激后降低，并于4 h达到最低值。各实验组干预4 h后，eHSP70组与血必净+eHSP70组细胞Ang-2的mRNA及蛋白表达量较空白对照组显著增高（P＜0.05），而血必净+eHSP70组的表达量较eHSP70组显著下降（P＜0.05）；与空白对照组相比较，eHSP70组VE-cadherin的mRNA及蛋白的表达量显著降低（P＜0.05），而血必净+eHSP70组及血必净组上述指标表达量均显著上升（P＜0.05），其中尤以血必净组的表达增高最为显著（P＜0.05）。【结论】血必净注射液通过调控eHSP70 对Ang-2与VE-cadherin的表达影响，对创伤刺激的血管内皮细胞具有一定的保护作用。

血必净注射液；细胞外热休克蛋白70；血管生成素2；血管内皮钙黏蛋白；内皮细胞；细胞培养

近期研究表明，机体受到创伤、低氧等刺激后可以释放损伤相关分子模式（DAMP）分子，与病原体相关分子模式（PAMP）分子协同作用激活先天免疫系统促发炎症反应进而造成血管内皮的功能障碍［1］。其中细胞外热休克蛋白70（eHSP70）是DAMP分子中研究的热点。而血管内皮细胞释放血管生成素2（Ang-2）是血管内皮损伤的生物标志物，本课题组前期研究表明Ang-2是影响脓毒症患者病情严重程度的独立危险因素［2］。血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）作为细胞黏附连接中的重要组成蛋白，对内皮细胞通透性影响十分显著［3］。本研究观察了血必净注射液对创伤后内皮细胞Ang-2及VE-cadherin的影响，现报道如下。

1　材料与方法

1.1细胞株人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）细胞株由广东医学院附属医院临床医学研究中心何惠娟老师赠送。

1.2主要试剂和仪器eHSP70（以色列ProSpec公司）；DMEM（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；逆转录试剂盒（KP106-02）及荧光定量PCR试剂盒（FP205-02）购于中国TIANGEN公司；兔抗人血管生成素2抗体（美国abcam公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；引物（上海生工股份有限公司）；血必净注射液（主要成分为红花、赤芍、川芎、丹参、当归等，生药浓度为500 g/L，10 mL/支静脉注射制剂，批号：04202）；7500荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；PowerPac通用电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3细胞培养HUVECs复苏传代后，取3～8代生长良好的内皮细胞，接种于6孔培养板中，待细胞长成单层后，换成含体积分数为2%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养液培养12 h，使细胞生长同步于G0期用于实验。

1.4不同时间的eHSP70刺激实验G0期细胞加入无菌过滤的eHSP70（终浓度为0.1 μg/mL）培养基，分别于0、2、4、8、16、32 h这6个时间点收集细胞用于提取蛋白和RNA以明确最佳刺激时间。

1.5血必净干预实验①空白组：无血清培养基培养；②eHSP70组：无血清培养基含eHSP70（终浓度0.1 μg/mL）［4］；③血必净组：加入终浓度为50 mg/mL的血必净无血清培养基培养［5］；④eHSP70+血必净组：依次加入eHSP70（终浓度0.1 μg/mL）和血必净（终浓度为50 mg/mL）培养；各组培养时间为最佳刺激时间，然后收集细胞提取总RNA和蛋白进行检测。

1.6实时荧光定量PCR检测Ang-2、VE-cadherin表达从GenBank获取待测基因的cDNA序列，通过Primer Premier 5.0软件设计引物，序列为：Ang-2正向引物5’-AACTTTCGGAAGAGCATGGAC-3’，反向引物5’-CGAGTCATCGTATTCGAGCGG-3’；VE-cadherin正向引物5’-AGGACATAACACCACGAAACG-3’，反向引物5’-CGGTCAAACTGCCCATACTT-3’；GADPH正向引物5’-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3’，反向引物5’-CAGTGATGGCATGGACTGTG-3’。采用Trizol试剂提取各组细胞总RNA并测定纯度和浓度，取每组RNA各1 μg，反转录成cDNA，使用含SYBR Green I染料的扩增试剂，按使用说明书进行，反应体系为10 μL。反应程序为：95℃预变性15 min，随后的40个循环包括95℃、10 s，60℃、32 s。每种待测基因均行3复孔检测，实验重复3次，反应结束获Ang-2、VE-cadherin、GADPH mRNA的循环阈值（Ct），采用△△Ct（△△Ct= △Ct-△△Ct基础值，△Ct=Ct目的-Ct内参）法进行相对定量分析，以2-△△Ct法［6］作为目的RNA的相对表达量。

1.7Western blot检测Ang-2、VE-cadherin蛋白的表达收集上述各时间组及药物处理组细胞，并提取细胞总蛋白，以二喹啉甲酸（BCA）法［7］进行蛋白定量。各组取总蛋白约30 μg进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行蛋白质分离，随后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h后，分别加入兔抗人Ang-2多克隆抗体、兔抗人VE-cadherin单克隆抗体、兔抗人GAPDH单克隆抗体（工作浓度分别为1∶500、1∶5 000、1∶500），4℃孵育过夜；次日加入二抗（工作浓度为1∶5 000），室温孵育1 h后用超敏辣根过氧化物酶（ECL）化学发光试剂盒显色，于暗室曝光。各组实验重复3次，条带使用Image J分析软件分析灰度值，以Ang-2、VE-cadherin与内参 GAPDH的灰度值比值（p）表示Ang-2、VE-cadherin蛋白相对含量。

1.8统计方法应用SPSS 17.0软件对所有数据进行统计分析，结果采用均数±标准差（±s）表示，各组间均数的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同时间点的eHSP70刺激后内皮细胞的Ang-2及VE-cadherin表达变化

2.1.1内皮细胞的Ang-2、VE-cadherin mRNA水平变化图1结果显示：经eHSP70刺激后，其他各时间组与0 h组比较，内皮细胞Ang-2 mRNA表达均显著增加（P＜0.05），其他各时间组与4 h组比较，Ang-2 mRNA表达均显著降低（P＜0.05）；经eHSP70刺激后，其他各时间组与0 h组比较，内皮细胞VE-cadherin的mRNA表达量均显著降低（P＜0.05），其他各时间组与4 h组比较，VE-cadherin 的mRNA表达均显著增高（P＜0.05）。

图1　eHSP70刺激后各时间组细胞Ang-2和VE-Cadhein的mRNA表达　（±s，N=6）Figure 1　Ang-2 and VE-cadherin mRNA expression in HUVEC at different time points after eHSP70 stimulation

2.1.2内皮细胞的Ang-2及VE-cadherin蛋白水平变化图2和图3结果显示：与0 h组比较，其他各时间组内皮细胞Ang-2的蛋白表达均显著增加（P＜0.05）；其他各组与4 h组比较，Ang-2的蛋白表达均显著降低（P＜0.05）。与0 h组比较，其他各时间组内皮细胞VE-cadherin的蛋白表达量均显著降低（P＜0.05）；其他各组与4 h组比较，VE-cadherin的蛋白表达均显著增高（P＜0.05）。

图2　eHSP70刺激后各时间组细胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表达凝胶电泳图Figure 2　Gel electrophoresis results for Ang-2 andVE-cadherin protein expression in HUVEC at different time points after eHSP70 stimulation

图3　eHSP70刺激后各时间组细胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表达　（±s，N=6）Figure 3 Ang-2 and VE-cadherin protein expression in HUVEC at different time points after eHSP70 stimulation

2.2eHSP70刺激4 h后各实验组之间细胞Ang-2和VE-cadherin的表达水平变化

2.2.1各实验组之间细胞Ang-2和VE-cadherin的 mRNA水平变化图4结果显示：经eHSP70刺激4 h后，与空白组比较，eHSP70组及eHSP70+血必净组的内皮细胞Ang-2 mRNA表达量均显著增加（P＜0.05），而血必净组差异无统计学意义（P＞0.05）；与eHSP70组比较，血必净组及eHSP70+血必净组表达量均较之显著下降（P＜0.05）。经eHSP70刺激4h后，与空白组比较，eHSP70组VE-cadherin的mRNA表达量显著降低（P＜0.05），血必净组及eHSP70+血必净组VE-cadherin的表达增高（P＜0.05），其中尤以血必净组增高为显著（P＜0.05）。

图4　各组细胞Ang-2、VE-cadherin mRNA表达的影响Figure 4 Comparison of Ang-2 and VE-cadherin mRNA expression level in HUVEC of different groups（±s，N=6）

2.2.2各组细胞Ang-2和VE-cadherin的蛋白表达水平变化图5和图6结果显示：经eHSP70刺激4 h后，与空白组比较，eHSP70组及eHSP70+血必净组的内皮细胞Ang-2蛋白表达量均显著增加（P＜0.05），而血必净组差异无统计学意义（P＞0.05）；与eHSP70组比较，血必净组及eHSP70+血必净组表达量均显著下降（P＜0.05）。经eHSP70刺激 4 h后，与空白组比较，eHSP70组VE-cadherin的蛋白表达量显著降低（P＜0.05），血必净组及eHSP70+血必净组VE-cadherin的表达增高（P＜0.05），其中尤以血必净组增高为显著（P＜0.05）。

图5　各组细胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表达电泳图Figure 5 Gel electrophoresis results for Ang-2 and VE-cadherin protein expression in HUVEC of different groups

图6　各实验组细胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表达影响的电泳图Figure 6 Comparison of Ang-2 and VE-cadherin protein expression levels in HUVEC of different groups showed by gel electrophoresis　（±s，N=6）

3　讨论

研究表明，eHSP70在创伤等应激后循环血液和体液中会明显增加［8-9］。早期Ganter［10］证实，在临床创伤早期无微生物感染阶段Ang-2呈现明显上升。Ang-2作为血管内皮细胞损伤的重要生物标志物，在创伤患者中的升高是否与eHSP70的作用相关目前尚未明确。eHSP70作为DAMP的一员，其受体与PAMP分子中的细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）相似，主要通过Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）中的TLR2和TLR4进行信号传导，诱发炎症因子的转录和表达［4］。本课题组前期已证实脓毒症患者血浆Ang-2与脂多糖（LPS）呈正相关［2］。由此推断，eHSP70可能通过调控Ang-2的表达从而进一步导致内皮功能障碍。由于eHSP70能促进多种炎症因子的释放，并且机制复杂，关于eHSP70刺激炎症因子释放的最佳时间点仍尚未达成共识。Asea等［4］使用eHSP70刺激外周血单核细胞2 h后，白细胞介素1（IL-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等炎症因子明显增高。本研究结果显示：经eHSP70刺激后，各时间组内皮细胞Ang-2的mRNA和蛋白表达量较空白组明显增高，并且4 h达到表达峰值，提示4 h是eHSP70的最佳刺激时间，这与Alexzander Asea的结果较为一致。本研究证实eHSP70对Ang-2的表达具有上调作用，这为今后创伤后炎症损伤的研究提供了一定的理论依据。

内皮细胞间连接包括紧密连接、黏附连接、缝隙连接和韧带连接［11-12］，其对内皮通透性起着主要的调控作用。随着人们对炎症研究的深入，关于eHSP70升高引起内皮功能障碍的研究取得了一定进展。De Maio［13］的研究表明，HSP70能够影响内皮细胞缝隙连接，从而使内皮细胞间通透性增加。众所周知，VE-cadherin通过与β-catenin结合形成VE-cadherin/β-catenin复合体是内皮粘附连接的关键因素［14］。黏附连接蛋白表达的可调控性，对内皮细胞通透性影响十分显著。但目前关于eHSP70是否通过调控VE-cadherin的表达进而导致血管通透性增加、炎症因子渗漏的文章鲜有报道。本研究显示经eHSP70刺激后，内皮细胞VE-cadherin的mRNA和蛋白表达量较空白组明显降低，提示eHSP70通过对VE-cadherin的作用导致内皮通透性增加。

血必净注射液作为一种活血化瘀药物组成的中草药提取制剂，有文献［15］证实其具有拮抗内毒素、调节免疫、下调炎症因子、保护脏器等作用。然而，对于创伤后的无菌性炎症机制的研究，以及血必净注射液对创伤后内皮细胞损害是否有保护作用的探讨鲜有报道。本研究结果表明血必净注射液显著抑制了eHSP70引起的Ang-2表达上调，但对正常的内皮细胞Ang-2表达无明显影响；此外血必净也显著减弱了eHSP70对VE-cadherin表达的抑制作用，并且还能上调正常内皮细胞VE-cadherin的表达。张宏业等［16］证实血必净注射液作用后，急性缺血性脑卒中并发SIRS患者血清中TNF-α、IL-6水平明显下降。高红梅等［17］体外研究表明，以内毒素刺激内皮细胞，同时予血必净注射液加以干预，内皮细胞培养液中血管性血友病因子（vWF）及内皮素（ET）含量明显下降，提示血必净对脓毒症引起的内皮损伤具有一定的保护作用。陈硕等［18］证实，血必净能下调脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞HMGB-1、RAGE等促炎因子的释放，结合上述研究提示血必净既能抑制感染引起的炎症作用，也能抑制创伤引起的炎症反应。

综上所述，eHSP7能诱导Ang-2的表达，同时抑制VE-cadherin的表达，其诱导作用于4 h最显著，血必净能明显抑制eHSP70对内皮细胞的上述作用。本研究结果表明血必净注射液不仅能拮抗脓毒症引起的炎症反应，而且对创伤后eHSP70引起的内皮损伤具有显著的保护作用。这为今后血必净在创伤炎症方面的治疗提供了新的研究方向和理论依据。

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【责任编辑：黄玲】

Influence of Xuebijing Injection on Formation of Angiopoietin 2 and Cadherin in Vascular Endothelial Cells Injured by Traumatic Stress

TANG Jianyong1，ZHANG Haihui1，LI Tiansheng1，HE Huijuan2，ZHANG Yuanli1
（1.Intensive Care Unit of Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000 Guangdong，China；2.Clinical Medical Research Center of Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000 Guangdong，China）

Objective To observe the changes of angiopoietin 2（Ang-2）and vascular endothelial cadherin（VE-cadherin）in vascular endothelial cells injured by analogue trauma stress induced by intracellular heat shock protein70 （eHSP70），and to explore the protective effect of Xuebijing Injection（XI）on the endothelial cells.Methods The expression levels of Ang-2 and VE-cadherin mRNA and protein in the cultured human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were monitored at hour 0，2，4，8，16，32 after eHSP70 stimulation for the screening of the optimal stimulating time.The cultured HUVEC were randomized into blank control group，eHSP70 group（eHSP70 at final concentration of 0.1 μg/mL），XI group（XI at final concentration of 50 mg/mL），and XI+eHSP70 group，and the levels of Ang-2 and VE-cadherin at the optimal stimulating time were observed.Results After eHSP70 stimulation，the quantity of Ang-2 mRNA and protein expression in HUVEC was increased and then arrived at the peak value at hour 4，and the quantity of VE-cadherin mRNA and protein expression was decreased and then arrived at the valley value at hour 4.After medicine intervention for 4 h，the quantity of Ang-2 mRNA and protein expression in HUVEC of eHSP70 group and XI+eHSP70 group was increased（P＜0.05 compared with that in the blank control group），and XI+eHSP70 group had lower Ang-2 mRNA and protein level than eHSP70 group（P＜0.05）.Compared with the blank control group，the quantity of VE-cadherin mRNA and protein expression in eHSP70 group was decreased obviously（P＜0.05），and XI+ eHSP70 group and XI group had higher VE-cadherin mRNA and protein level than eHSP70 group（P＜0.05），in particular XI group had the highest level（P＜0.05）.Conclusion XI has protective effect on traumatic-stress induced endothelial cells injury through regulating Ang-2 and VE-cadherin expression medicated by eHSP70.

Xuebijing Injection；intracellular heat shock protein 70；angiopoietin 2；vascular endothelial cadherin；endothelial cells；cell culture

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0560-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.027

2015-07-30；修改返回日期：2016-02-26

汤建勇（1989-），男，硕士研究生；E-mail：tjy_125@163.com

张媛莉（1970-），女，主任医师，硕士研究生导师；E-mail：zhangyuanly@126.com

广东省医学科研基金项目（编号：A2009484）