响应面法优化杏鲍菇多糖的提取及其抑菌活性

许　瑞，李凤英，崔蕊静，赵希艳，郭　朔，武朋林

(河北科技师范学院食品科技学院，河北 秦皇岛，066600)



响应面法优化杏鲍菇多糖的提取及其抑菌活性

许瑞*，李凤英，崔蕊静，赵希艳，郭朔，武朋林

(河北科技师范学院食品科技学院，河北 秦皇岛，066600)

为确定超声条件对杏鲍菇多糖得率的影响和评价其抑菌活性，采用响应面法(RSM)对超声提取杏鲍菇多糖的条件进行了优化。结果表明，最佳的超声提取条件为：提取时间82 min，提取温度95 ℃，功率213 W，提取剂用量20 mL/g。预测得率14.5%，试验测定值与预测值无显著性差异(P>0.05)。通过对大肠杆菌、变形杆菌、白色链球菌、产气杆菌、黑曲霉的抑菌试验表明，多糖对大肠杆菌和黑曲霉有较好的抑菌活性。试验结果表明，杏鲍菇多糖可作为潜在的功能性成分应用于医药或功能性食品。

杏鲍菇多糖；提取条件；抑菌活性；响应面法

杏鲍菇是一种可食性蘑菇，主要生长于亚洲地区、中东、欧洲地中海地区和非洲地区。杏鲍菇是平菇属种类中最多的一种，菌肉肥厚，菌柄乳白。杏鲍菇含有可刺激免疫系统的化学物质。试验证明，杏鲍菇中的主要成分多糖具有许多生物活性，包括抗肿瘤，抗氧化等[1]。

采用水提法从植物类物质中提取多糖具有耗时长[2,3,4]、耗水量大[5]等缺点。近来，超声技术应用于植物材料中提取多糖[6]。超声处理可提高物质在固相和溶剂之间转移，通过破坏细胞壁改善多糖的提取率。另一些研究报道显示，超声处理会对多糖产生有害影响，会导致多糖结构的改变[7]，但是还未有报道显示超声处理对杏鲍菇多糖(polysaccharides from Pleurotus eryngii，PPE)的抑菌活性是否有影响。多糖的结构与生物活性有关，例如游离基清除活力。因此，超声处理对多糖理化性质的影响还需要做更多、更深入的研究。响应面法可有效地发现在不同条件下提取PPE时各种参数的相互作用，以及这些参数对PPE得率的影响。虽然超声提取技术已广泛用于不同原料的提取，但是对PPE的提取还没有文献报道。为此，笔者探讨超声处理对PPE得率的影响及PPE的抑菌活性。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

杏鲍菇购于秦皇岛市昌黎县。DPPH购于Sigma公司，其他化学品和试剂均在当地购买，并全部为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1多糖提取方法杏鲍菇的菌核用体积分数为0.80的乙醇在80 ℃下回流提取2 h，共进行3次。将杏鲍菇切碎，60 ℃干燥后研磨粉碎，得到的杏鲍菇粉末4 ℃保存。每次提取都称量5 g杏鲍菇粉末，采用超声波清洗器(GDS-1012T，中国)在不同的超声时间(60，80，100，120，140 min)、温度(55，65，75，85，95 ℃)、提取剂用量(5，10，20，40，60 mL·g-1)和功率(100，200，300，400，500 W)条件下提取，所得萃取液经Whatman Nr 1滤纸过滤，然后将浓缩滤液在50 ℃下用旋转蒸发器真空浓缩，并用Sevag试剂[8]去除提取物中的蛋白。除去Sevag试剂后，在体积分数为0.95的乙醇溶液中加入提取物，4 ℃保持过夜以沉淀多糖。将沉淀物在3 000×g下离心10 min收集沉淀，然后用丙酮和石油醚冲洗并冻干，用干燥后的沉淀物计算多糖得率[3]。

1.2.2响应面法软件OriginPro (Version 8.0, USA)用于试验设计、数据分析和模型构建。用4因素二次回归旋转设计来确定响应模式，然后建立相应的模型。本次试验中4个变量因素分别为超声时间(X1)、温度(X2)、功率(X3)和提取剂用量(X4)，每个变量都为5水平，因变量为PPE的得率。方程中的代表符号和水平见表1。试验设计中的7次重复试验用于评估纯误差平方和，所有的试验点均进行了3次测定。

表1　PPE提取的设计因素和水平

1.2.3抑菌性测定多糖提取物抑菌活性的测定中，测定了一些与食品相关的细菌如大肠杆菌、变形杆菌、白色链球菌、产气杆菌、黑曲霉。各种微生物菌株的培养物接种在牛肉膏蛋白胨培养基(细菌)和马铃薯葡萄糖琼脂(真菌)中于4 ℃保藏。抑菌活性试验基于纸片法[9]，将10 mg多糖粉末溶于DMSO(二甲基亚砜)体积分数为0.10的溶液中，以毫米为单位测量无菌纸片的抑菌圈直径。

2　结果与分析

2.1超声提取条件对PPE得率的影响

超声功率、时间、温度及提取剂用量对PPE得率的影响，以及它们之间的相互关系见图1～图6。3D曲面图说明了自变量对因变量的主要作用和相互作用，每一个变量都表现出和PPE得率之间有复杂的关系。实验结果表明，超声时间越长，温度越低，PPE得率就越大(图1)；在恒定的超声功率和某段范围内的温度作用下，PPE得率随着超声时间延长增大到某一值后就开始降低。

当超声功率处于较低范围内时，PPE得率随着超声功率增加而增加(图2)；当超声功率位于较大值时，会得到相反的结果。一般情况下延长超声时间可提高提取率，但是当使用较高的超声功率时，PPE得率随着超声时间延长而降低，这可能是由于超声波作用使得多糖发生了降解。在较高的超声温度下，液体的粘度和密度降低可进行快速传质[10,11]。并且，较高的超声温度会导致气泡数目和表面接触面积增加。因此，适宜的超声温度可提高提取效率。

当超声功率为200 W时，超声温度对PPE得率表现出积极的影响(图4)；当超声功率为250 W时，超声温度有不同的作用效果。当超声功率较高时，超声温度对PPE得率表现出负面作用，产生这种现象可能的原因是超声波和高温对多糖的降解作用[12,13]。

提取剂用量对PPE提取率表现出线性作用，而超声时间、温度和功率表现出二次效应(图3，图5，图6)。图6表明的是提取剂用量(X4)和超声功率(X3)对PPE得率的影响。当提取剂用量较高时，随着超声功率的降低，PPE得率增加至最大值，然后再降低(图6)。但是当提取剂用量较低时，多糖提取率表现为不断上升。

综合以上情况，增加所有4个因素在一定程度上都可以提高杏鲍菇多糖的得率，如果是采用较高提取温度或较长提取时间，就会降低PPE得率。超声法能够提高多糖的得率归因于对细胞的破坏、更好的溶剂渗透和物质传递。因此，由于超声法的高效性，超声处理是一种理想的提取PPE的方法。

2.2模型拟合

一般情况下，响应曲面的优化可能会产生不理想或误导性的结果，除非该模型表现出良好的拟合，这就有必要进行模型检验。表2为从试验设计中得出的PPE得率的优化条件，试验设计中包含31次测试，每个变量的不同水平分别编码为-γ，-1，0，+1，γ来进行统计分析。PPE得率的结果示于表2中，根据试验结果，不同的提取条件下会提取出不同数量的多糖。

表示PPE得率的数学模型，是所研究区域内的自变量函数的数学模型，以等式表示为：

Y=-179.6+0.81X1+2.61X2+0.31X3+0.32X4-0.004 8X1X2-0.000 015X1X3-

式中Y为PPE得率；X1，X2，X3，X4分别为超声时间、温度、功率和提取剂用量的编码变量。

图1　提取时间和提取温度对PPE得率的响应面　　　　图2　超声功率和提取时间对PPE得率的响应面

图3　提取时间和提取剂用量对PPE得率的响应面　　　　图4　超声功率和提取温度对PPE得率的响应面

图5　提取温度和提取剂用量对PPE得率的响应面　　　　图6　超声功率和提取剂用量对PPE得率的响应面

表2　响应面法优化杏鲍菇多糖提取的试验设计方案及结果

从变量的模型分析结果看，PPE得率和变量之间的关系是显著的，计算得出的p值小于0.1并且相关系数为0.997(表3)。相关系数(R2)被定义为解释变异与总变异的比值，是一种拟合程度的测定。R2值越小就表明模型中相关变量的相关性越差。当R2趋于1时，模型可与实际数值吻合。经方差分析，PPE得率模型的R2值为0.994 5，这表明回归模型很好的定义了该系统的实际情况。

表3　响应面法优化杏鲍菇多糖提取的试验结果方差分析

通过回归模型的预测，提取PPE的最佳条件为：213 W，82 min，95 ℃和20 mL/g。在此条件下提取PPE的得率为14.1%，但是在95%置信区间内它和预测值14.5%无显著性差异。

统计分析表明，4个自变量及其二次项对PPE的得率有显著影响，并且在X2和X3及X2和X4之间都有显著的交互作用(P<0.01)。这些结果表明PPE提取率存在一个最大值。

表4　杏鲍菇多糖提取物的抑菌活性

2.3多糖抑菌活性

与大肠杆菌、变形杆菌和黑曲霉相比较，多糖提取物对白色链球菌和产气杆菌表现出较低的抑菌活性(表4)，原因可能是这两种微生物含有孢子，使其具有很强的抗逆性和抗药性。多糖提取物对白色链球菌无抑菌活性。

3　结论与讨论

响应面图表明了超声功率、时间、温度和提取剂用量对多糖的提取率具有重要、复杂的影响。超声时间、温度、功率和提取剂用量是影响提取多糖的重要因素。满足多糖最大提取率的超声提取条件为：82 min,95 ℃,213 W和20 mL/g。超声提取技术是一种有效的从杏鲍菇中提取多糖的方法。在最适合的超声条件下提取多糖，多糖提取率为14.1%±0.95%，与预测值无明显差异(P>0.05)。这说明响应面法有很好的预测性，它界定了超声提取条件和PPE得率之间的非线性关系。但是，多糖结构和抑菌活性之间的特定联系还是未知的，还需要进行更详尽的研究来阐明生物活性，并确定生物活性变化的真正原因。

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(责任编辑：朱宝昌)

Optimization of Ultrasonic Extraction of Polysaccharides fromPleurotusEryngiiby Response Surface Methodology and Evaluation of Their Antibacterial Activities

XU Rui,LI Fengying,CUI Ruijing,ZHAO Xiyan,GUO Shuo,WU Penglin

(College of Food Science & Technology,Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao Hebei,066600，China)

An ultrasonic technique was employed to extract polysaccharides fromPleurotuseryngii(PPE) in this study. The effects of ultrasonic conditions on the recovery and antioxidant activities of polysaccharides were evaluated. The optimal conditions for ultrasonic extraction of PPE were determined by response surface methodology (RSM). RSM was applied to evaluate the effects of four independent variants (ultrasonic power, time, temperature and solvent-solid ratio) on the recovery of PPE. The results indicated that the expected recovery of polysaccharides might reach 14.5% when the optimal ultrasonic conditions were as extraction time 82 min, extraction temperature 95 ℃, ultrasonic power 213 W and solvent-solid ratio 20 mL/g. The experimental determinations were not significantly different (P>0.05) from the expected value under the above condition. Meanwhile, the PPE antibacterial activities in vitro were evaluated, and tended to be antibacterial capacity to bothE.coliandAspergillusniger. PPE could be explored as a potential functional agent for medicine or functional foods.

Pleurotuseryngiipolysaccharide;extraction condition;antibacterial activities;response surface methodology

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.01.004

河北科技师范学院博士科研启动基金项目(项目编号：2013YB017)。

，男，博士，讲师。主要研究方向：多糖生物活性。E-mail: robust100@163.com。

2015-12-16; 修改稿收到日期: 2016-01-07

TQ914.1

A

1672-7983(2016)01-0020-06

许瑞(1980-)，男，博士，讲师。主要研究方向：多糖生物活性。