DHPM处理下 β乳球蛋白与油酸相互作用对其功能性质的影响

刘成梅,俞宏达,钟俊桢,洪启通,刘　伟

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)



刘成梅,俞宏达,钟俊桢*,洪启通,刘伟

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

采用动态高压微射流处理β-乳球蛋白与油酸混合物,研究β-乳球蛋白与油酸相互作用对其功能性质和表面疏水性的影响。与标准β-乳球蛋白相比,未经DHPM处理的混合物的功能性质和表面疏水性没有显著性变化(p>0.05)。随着DHPM压力从40 MPa增至160 MPa,β-乳球蛋白油酸复合物的溶解度、乳化性、起泡性和表面疏水性都呈先增加后减少的趋势。溶解度和起泡性在80 MPa压力条件下达到最大,分别为95.36%和32.00%。而乳化性和表面疏水性呈正相关关系,在120 MPa压力条件下达到最大,分别为1.09和640.20。结果表明功能性质和表面疏水性的变化与不同DHPM压力下β-乳球蛋白与油酸相互作用的程度有关。

β-乳球蛋白,油酸,动态高压微射流,功能性质

乳清因具有良好的功能性质,被广泛应用于食品产品中[1]。β-乳球蛋白是乳清的主要成分,由162个氨基酸组成,含有9条β-折叠股和一个α-螺旋,其中8条β-折叠股形成一个疏水空腔[2]。

β-乳球蛋白作为载脂蛋白,能与脂肪酸、视黄醇等疏水小分子形成复合物,其中β-桶疏水空腔是其最主要的结合位点[3]。从牛奶中提取的β-乳球蛋白含有部分β-乳球蛋白脂肪酸复合物[4],与其结合的脂肪酸主要是软脂酸和油酸,大约占75%比例[5]。β-乳球蛋白与脂肪酸疏水结合后蛋白质结构稳定性显著增加,对蛋白酶酶解作用、热诱导变性和离液剂诱导变性的抵抗能力提高[4,6-7]。有研究表明[2,8],β-乳球蛋白与亚油酸钠或油酸钠复合物对肿瘤细胞具有细胞毒性。

然而,目前很少有关于β-乳球蛋白脂肪酸复合物功能性质方面的研究。本实验采用动态超高压微射流处理β-乳球蛋白与油酸混合物以促进β-乳球蛋白与油酸相互作用。动态超高压微射流(DHPM)是一种新兴的物理改性技术,通过高压对液体物料进行高速撞击、强烈剪切、空穴膨爆等综合作用,起到超微细化、乳化和均一化效果,进而对其理化性质产生影响[9]。本实验主要研究不同DHPM压力处理后β-乳球蛋白油酸复合物功能性质和表面疏水性的变化,以期为改性β-乳球蛋白在乳制品中的应用提供一定的理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

牛β-乳球蛋白、油酸购于美国Sigma公司；其他所需试剂均为分析纯。

紫外分光光度计北京谱析通用公司;F-4500荧光分光光度计日立HITACHI公司;M-7125 Microfluidics微射流均质机(DHPM)国Microfluidics公司。

1.2实验方法

1.2.1复合物的制备将β-乳球蛋白与油酸以1∶4的质量比混匀在pH7.4的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)中,β-乳球蛋白的浓度为1 mg/mL。将混合溶液均分成5等份,分别在40、80、120、160 MPa不同DHPM表压力下处理3次,超滤除去未结合的油酸,收集样品并4 ℃保存。未加油酸的β-乳球蛋白作为空白对照。本实验用0.1 MPa表示未经过DHPM压力处理。

1.2.2溶解度的测定根据文献[10],分别取等量样品溶液,在15000×g下离心15 min,取上清液。上清液中蛋白质的含量以牛血清白蛋白做标准用考马斯亮蓝G-250法进行测定。

1.2.3乳化性的测定根据文献[10],分别取5 mL样品溶液,边搅拌边缓缓加入一级油5 mL,PBS缓冲液10 mL,于10000 r/min高速均质1 min制成乳状液,从底部吸取乳状液50 μL,立即与5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)混合,然后用分光光度计于500 nm处测其吸光度,实验重复三次。乳化性大小用吸光度值表示。

1.2.4起泡性的测定根据文献[10],分别取10 mL样品溶液,在室温下于微射流均质机中均质1 min,转速为5000 r/min,然后快速移至100 mL量筒内,记录泡沫的体积,实验重复三次。按下式计算起泡性。

起泡性=泡沫体积×100%/溶液体积

1.2.5表面疏水性的测定根据文献[11],分别取4 mL样品溶液,加入20 μL的1-苯胺基-8-萘(1-anilino-8-naphthalene sulfonic acid,ANS)溶液(8 mmol/L ANS溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液),立即摇匀,在F-4500荧光分光光度计中于390 nm波长激发,检测发射荧光光谱,以最大发射波长处的相对荧光强度表示表面疏水性。

1.2.6数据统计分析所有实验重复三次,结果以“平均值±标准偏差”表示。使用SPSS 19.0统计分析软件,One-Way ANOVA用于单因素方差分析,Tukey法比较平均值之间的差异性(p≤0.05)。作图采用Origin 8.6软件。

2　结果与分析

2.1溶解度

蛋白质的溶解度大小与蛋白质与蛋白质,蛋白质与水,蛋白质与离子和离子与水等相互作用有关[12]。在pH7.4下,β-乳球蛋白与油酸在不同DHPM压力条件下形成的复合物的溶解性见图1。如图1所示,对照组的β-乳球蛋白的溶解度为82.32%±1.82%。经过0.1、40、80、120、160 MPa处理后,β-乳球蛋白油酸复合物的溶解度分别为81.17%±2.10%、87.13%±2.48%、95.36%±1.37%、86.21%±1.43%、82.78%±1.05%,呈先增高后减少的趋势。

图1　不同DHPM压力条件下β-乳球蛋白 与油酸复合物的溶解度Fig.1　The solubility of β-lactoglobulin/oleic acid complex treated at different DHPM pressure注:不同的字母表示在p≤0.05水平上 有显著差异,图2～图4同。

蛋白质在水中的溶解度主要取决于蛋白质变性和聚集的程度[13]。与对照组相比,未经DHPM处理(0.1MPa)的蛋白质溶解度没有显著变化(p>0.05)。这可能由于不溶于水的油酸在简单混匀形成的体系中,难以与β-乳球蛋白发生相互作用。然而,β-乳球蛋白与油酸混合体系在动态高压微射流处理过程中,受到高速撞击、强烈剪切等综合作用,会形成均一、乳化的体系。在40 MPa和80 MPa压力条件下,复合物溶解度依次增加(p≤0.05),这可能因为β-乳球蛋白与油酸相互作用形成复合物引起的。油酸结合在β-乳球蛋白的疏水区域,减弱β-乳球蛋白之间的相互作用,因此复合物溶解度相对增加。而在120 MPa和160 MPa压力条件下,复合物溶解度都分别减小。前期研究[14]发现在120 MPa以上压力处理时,由于β-乳球蛋白的再聚集会导致疏水残基和自由巯基被包埋。在本实验中,这很可能减弱β-乳球蛋白与油酸之间的相互作用,导致复合物的溶解度相对降低。

2.2乳化性

蛋白质是两性大分子,能在油水界面形成紧密的薄膜[15]。在本实验中,通过蛋白质和油形成的乳化液在500 nm下的吸光度值表示蛋白质的乳化性。如图2所示,对照组的β-乳球蛋白的吸光度值为0.72±0.02。与对照组相比,未经DHPM处理(0.1 MPa)的样品乳化性为0.73±0.02,没有显著性变化(p>0.05)。经过40、80、120、160 MPa不同压力处理后,复合物的吸光度值分别为0.76±0.03、0.89±0.04、1.09±0.06和0.81±0.03。

这可能是因为油酸易溶于大豆油,β-乳球蛋白油酸复合物能更容易地吸附到油水界面。同时DHPM处理会导致β-乳球蛋白埋藏内部的疏水基团的暴露。许多文献表明蛋白质疏水基团的暴露会增加蛋白质的乳化性[16-18]。在160 MPa压力条件下,复合物的乳化性显著性减少。前期研究发现高压处理下β-乳球蛋白容易发生再聚集现象[14]。这种蛋白质的再聚集可能导致β-乳球蛋白疏水残基和巯基被包埋在蛋白质构象内,从而减弱β-乳球蛋白与油酸之间的相互作用,导致乳化性相对降低。

图2　不同DHPM压力条件下β-乳球蛋白 与油酸复合物的乳化性Fig.2　The emulsifying activity of β-lactoglobulin/oleic acid complex treated at different DHPM pressure

2.3起泡性

蛋白质作为两亲大分子,在分散液中具有降低气-液界面的表面张力的作用,剧烈搅拌能形成泡沫。分散液形成泡沫时,蛋白质分子需吸附到气-水界面,并伴随着折叠化和重排过程[19]。如图3所示,天然β-乳球蛋白的起泡性为14.33%±2.08%。经过0.1、40、80、120、160 MPa不同压力处理后,复合物的起泡性分别为15.00%±2.00%、20.00%±2.00%、32.00%±2.00%、25.00%±1.00%、22.33%±2.52%。

图3　不同DHPM压力条件下β-乳球蛋白 与油酸复合物的起泡性Fig.3　The foaming activity of β-lactoglobulin/oleic acid complex treated at different DHPM pressure

蛋白质溶解度是影响蛋白质功能性质的重要性质之一。在一定程度内,蛋白质起泡性变化与其溶解度有关[20]。在本实验结果中,β-乳球蛋白油酸复合物起泡性的变化与溶解度变化趋势是一致的。通过对溶解度的分析,这可能说明β-乳球蛋白油酸复合物更容易吸附到气水界面以形成薄膜。

2.4表面疏水性

测定蛋白质的表面疏水性是准确预测蛋白质功能性质的必不可少的一步[18]。图4为在不同DHPM压力条件的样品中ANS的发射荧光光谱。在本实验中,通过ANS荧光光谱的最大荧光强度来表示β-乳球蛋白的表面疏水性大小。在图4中,对照组的ANS发射荧光光谱的最大发射波长以及最大荧光强度分别为490.00 nm和153.70。

图4　不同DHPM压力下β-乳球蛋白油酸复合物的 ANS荧光发射光谱Fig.4　The ANS fluorescence emission spectra of β-LG/oleic acid complex treated at different DHPM pressure

经过不同压力0.1、40、80、120、160 MPa处理后,复合物的ANS荧光光谱的最大发射波长逐渐蓝移至488.00、476.40、474.40、473.60、473.00 nm。在相关的研究中[21-22],ANS与β-乳球蛋白结合的位置主要在β-桶内部和β-桶与α-螺旋之间的凹槽,而脂肪酸以比ANS大2～3个数量级的结合常数竞争结合在β-桶内部。在本实验中,DHPM压力处理引起的β-乳球蛋白与油酸的相互作用导致ANS与β-乳球蛋白结合位置的环境极性发了变化,因此ANS荧光发射光谱发生蓝移。

在0.1、40、80、120、160 MPa压力条件下,最大荧光强度分别为157.80、312.00、397.10、640.20和463.00。前期研究发现β-乳球蛋白在DHPM处理中内部疏水基团容易暴露[14]。疏水基团的暴露可能同时增强β-乳球蛋白与油酸之间的相互作用,从而促使其表面疏水性逐渐增加。然而,当压力达到160 MPa时,蛋白质在高压环境下发生再聚集现象,疏水集团被包埋在蛋白质构象内部,同时减弱β-乳球蛋白与油酸之间的相互作用,导致表面疏水性降低。另外,许多文献[20,23]指出,蛋白质表面疏水性与乳化性有着正相关的关系。如图5所示,在本实验中的表面疏水性与乳化性同样有着正相关的关系(p≤0.05)。

图5　表面疏水性与乳化性的相关性Fig.5　Correlation relationship between surface hydrophobicity and emulsifying ability

3　结论

长链脂肪酸难溶于水,要与溶液中的蛋白发生相互作用,可以通过物理手段形成乳化液或者加入乙醇等有机溶剂。动态高压微射流是一种新兴的物理改性技术,β-乳球蛋白与油酸混合体系经过动态高压微射流处理后会形成均一、乳化的体系。与标准β-乳球蛋白相比,未经DHPM处理的混合物的功能性质和表面疏水性没有显著性变化(p>0.05)。经过不同DHPM压力处理后,β-乳球蛋白的ANS荧光发射光谱蓝移表明β-乳球蛋白与油酸发生了相互结合。经过40、80、120、160 MPa不同压力处理后,β-乳球蛋白油酸复合物的溶解度、乳化性、起泡性和表面疏水性都有随压力增加呈先增加后减少的趋势,复合物的溶解度分别为87.13%±2.48%、95.36%±1.37%、86.21%±1.43%、82.78%±1.05%;复合物的乳化性分别为0.76、0.89、1.09和0.81;复合物的起泡性分别为20.00%±2.00%、32.00%±2.00%、25.00%±1.00%、22.33%±2.52%;复合物表面疏水性分别为312.00、397.10、640.20和463.00。其中,乳化性和表面疏水性正相关,都在120 MPa压力条件下达到最大值。溶解度和起泡性都在80 MPa压力条件下达到最大值。β-乳球蛋白油酸复合物功能性质和表面疏水性的变化与不同DHPM压力下β-乳球蛋白与油酸相互作用的程度有关。

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Effect of interaction with oleic acid on functional properties ofβ-Lactoglobulin during DHPM treatment

LIU Cheng-mei,YU Hong-da,ZHONG Jun-zhen*,HONG Qi-tong,LIU Wei

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The mixture ofβ-lactoglobulin(β-LG)and oleic acid was treated by dynamic high pressure mircrofluidization(DHPM). The effect of interaction with oleic acid on the functional properties and surface hydrophobicity ofβ-LG during DHPM treatment was investigated. Compared with standardβ-LG,the functional properties and surface hydrophobicity of the unteated mixture had no significant changes(p>0.05). With DHPM pressure increasing from 40 MPa to 160 MPa,the functional properties and surface hydrophobicity ofβ-LG/oleic acid complex were increased initially and then decreased. At 80 MPa,the solubility and foaming activity of complex were the biggest,respectively,95.36% and 32.00%,while the maximum surface hydrophobicity and emulsifying activity of 640.20,1.09 were obtained at 120 MPa respectively. A positive correlation between surface hydrophobicity and emulsifying activity was observed. The results indicated that the changes of functional properties and surface hydrophobicity were related to the extent of the interaction betweenβ-LG and oleic acid altered by DHPM treatment.

β-lactoglobulin;oleic acid;dynamic high pressure mircrofluidization;functional properties

2015-06-18

刘成梅(1963-),男,博士,教授,研究方向:食物资源利用与开发,E-mail:916504978@qq.com。

钟俊桢(1984-),女,博士,副研究员,研究方向:食品科学与工程,E-mail:zhongjunzhen@163.com。

国家自然科学基金资助项目(21366021)；南昌大学食品科学与技术国家重点实验室青年研究基金项目资助(SKLF-QN-201518)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)03-0088-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.009