四川传统发酵肉中乳酸菌的分离及发酵特性研究

黄　丹，刘有晴，于　华，毛　祥，刘达玉，程　华，汪礼全

(1.四川理工学院 生物工程学院,四川自贡 643000；2.肉类加工四川省重点实验室,四川成都 610106)



四川传统发酵肉中乳酸菌的分离及发酵特性研究

黄丹1，刘有晴1，于华1，毛祥1，刘达玉2，程华1，汪礼全1

(1.四川理工学院 生物工程学院,四川自贡 643000；2.肉类加工四川省重点实验室,四川成都 610106)

对四川传统发酵肉中乳酸菌进行分离鉴定,并对其发酵特性进行研究。以四川腊肉为研究对象,采用平板划线法对乳酸菌进行分离纯化,利用16S rDNA的序列测定技术对其鉴定,并对分离菌株在不同温度、pH、NaCl浓度、亚硝酸盐浓度条件下的生长代谢、产酸能力进行研究,并对发酵产物中游离氨基酸进行测定分析。结果表明:筛选出的一株优势乳酸菌经分子生物学鉴定为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。分离菌株对数生长期为6～18 h;最适发酵温度30 ℃,发酵pH5.5;对NaCl及NaNO2耐受能力分别高达10%和150 mg/L;其代谢产物中共测出16种游离氨基酸,共包含5种人体必需氨基酸。

发酵肉,乳酸菌,鉴定,发酵特性,游离氨基酸

四川传统发酵肉制品主要包括腊肉、酱肉以及香肠等,虽然其前期生产工艺各不相同,但后熟工艺中微生物的代谢活动对其风味物质形成都有同样重要的贡献。四川传统发酵肉制品后熟过程中的微生物主要有细菌(包括乳酸菌和球菌等)、霉菌(主要是青霉菌)、酵母菌(主要是汉逊氏德巴利酵母和法马塔假丝酵母菌)等[1-2],其风味物质的形成主要依赖于这些微生物的次级代谢特别是氨基酸代谢过程,如带甲基分支的醛、次级醇、甲基酮、乙基酯、二甲基三硫化合物等。刘洋[1]在传统工艺的基础上,将乳酸菌和酵母菌株作为发酵剂接种于腊肉加工工艺过程中,发酵完成后实验组的pH、水分含量以及NaNO2残留量较未接种的产品低,产品口感及风味均有所提高。李湘丽[3]等对乳酸菌作为发酵剂在发酵香肠生产过程中的应用研究进展做了详细的综述,结果发现乳酸菌株不仅能改善产品风味,还能降低产品酸度,延长保质期。乳酸菌作为发酵肉制品生产的重要功能菌,大多数研究者只关注其产酸特性,实际上,乳酸菌通过其代谢活动所产生的丰富氨基酸,对促进发酵肉制品风味物质的形成具有重要作用[4]。因此,对该种类乳酸菌进行深入研究,有助于后续更加全面地对四川传统发酵肉制品风味物质合成进行有效控制的探索。

本研究采用稀释平板法对四川传统发酵肉制品中乳酸菌进行分离鉴定,研究温度、pH、NaCl浓度、亚硝酸盐对其生长繁殖及产酸能力的影响,分析分离菌株发酵产物中氨基酸成分,以期为乳酸菌在传统发酵肉制品中的应用提供基础数据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

四川农家腊肉自制;NaOH,邻苯二甲酸氢钾,磺基水杨酸均为分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;氨基酸标准溶液(Asp、Glu、Ser、His、Gly、Thr、Arg、Ala、Tyr、Cys、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys)上海西宝生物科技股份有限公司;MRS培养基。

Thermo酶标仪Multiskan FC,北京昊诺斯科技有限公司;日立L8900全自动氨基酸分析仪天美(中国)科学仪器有限公司。

1.2乳酸菌株分离鉴定

1.2.1乳酸菌分离纯化采用倾注培养法[5],用已灭菌剪刀剪碎腊肉并对其进行10倍梯度稀释,取10-4～10-7的稀释液500 μL于含有2% CaCO3的MRS固体培养基中,37 ℃培养48 h,挑取有溶钙圈的单菌落接种于MRS固体培养基中,进行多次划线分离,挑选革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的单菌落,并进行保藏。

1.2.2分离菌株DNA提取主要步骤为:取菌液于5 mL离心管中离心,取沉淀,加1.35 mL DNA抽提缓冲液、溶菌酶100 μL(10 mg/mL),于37 ℃摇床225 r/min振荡30 min;加300 μL 20% SDS,于65 ℃温浴2 h;加等体积酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1,v/v),于旋涡振荡器振荡2 min,静置10 min,25 ℃ 13000 r/min离心20 min;取上层水相,加0.6倍体积异丙醇,室温沉淀1～2 h;25 ℃ 13000 r/min,离心20 min,取沉淀;吸除异丙醇,加1 mL 70%乙醇,静置10 min,4 ℃ 13000 r/min离心15 min,重复1次;弃上清,吹风20 min,除尽乙醇;加50～100 μL双蒸水,65 ℃水浴1 h,4 ℃保存。1%琼脂糖凝胶电泳对DNA提取结果进行检测。

1.2.316S rDNA基因序列PCR扩增PCR扩增正向引物为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物为1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR扩增体系总体积50.0 μL,包括1.0 μL基因组DNA,5.0 μL10×Buffer(含2.5 mmol/L Mg2+),1.0 μL Taq聚合酶(5 U/μL),1.0 μL dNTP(10 mmol/L),1.5 μL正向引物,1.5 μL反向引物,39.0 μL ddH2O。采用超纯无菌水替代基因组DNA作为PCR阴性对照[6]。

PCR扩增反应程序:94 ℃预变性3 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min,30个循环,最后72 ℃延伸10 min。

将PCR扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳,并送往上海杰李生物技术有限公司进行序列测定。

1.2.4菌株同源性分析及系统发育树的构建将菌株序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对分析,运用MEGA6.0软件的相邻计算法构建系统发育树,判定目的菌株分类地位。

1.3分离菌株发酵特性研究

1.3.1分离菌株生长曲线及产酸特性将分离菌株接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h,以未接种菌液的MRS培养基做空白对照,每隔2 h取20 μL发酵液采用酶标仪测定其OD600值,每隔4 h取10 mL发酵液,采用电位滴定法测定总酸含量,每个样平行测定三次。

1.3.2温度对分离菌株生长代谢的影响将分离菌株接种于MRS液体培养基中,分别于20、30、40、50 ℃条件下培养24 h,以未接种菌液的培养基作空白对照,OD值与总酸测定同1.3.1,研究温度对分离菌株生长代谢的影响。

1.3.3pH对分离菌株生长代谢的影响将分离菌株接种于pH分别为3.5、5.5、7.5、9.5的MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h,以未接种菌液的培养基作空白对照,OD值与总酸测定同1.3.1,研究pH对分离菌株生长代谢的影响。

1.3.4NaCl对分离菌株生长代谢的影响将分离菌株接种于含盐量分别为0%、2%、4%、6%的MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h,以未接种菌液的培养基作空白对照,OD值与总酸测定同1.3.1,研究NaCl对分离菌株生长代谢的影响。

1.3.5亚硝酸盐对分离菌株生长代谢的影响将分离菌株接种于含亚硝酸钠含量分别为0、50、100、150 mg/L的MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h,以未接种菌液的培养基作空白对照,OD值与总酸测定同1.3.1,研究亚硝酸盐对分离菌株生长代谢的影响。

1.4分离菌株发酵产物氨基酸成分分析

样品前处理:取菌株发酵液500 μL于 25 mL容量瓶中,加入 10 mL 8%磺基水杨酸溶液,定容至刻度线。静置15 min,取一定量溶液过0.22 μm滤膜。所得滤液进行氨基酸分析。

检测条件[7-8]:Biochrom Li型阳离子交换树脂,4.6 μm×200 mm;测定波长570、440 nm;缓冲液流速25.0、31.2 mL/h;柱温程序:起始温度为31 ℃,11.5 min后以3 ℃/min,升温至65 ℃,约35 min后以3 ℃/min升温至76 ℃,52 min后以3 ℃/min降温至31 ℃;茚三酮溶液流速20.0 mL/h;分析时间125 min,进样量20 μL。每个样品重复进样2次。

2　结果与分析

2.1乳酸菌的分离鉴定

2.1.1乳酸菌形态学鉴定通过其产酸量的测定,筛选出一株优势乳酸菌株S8,其菌落形态为:乳白色,有光泽,边缘整齐,表面光滑,不透明;其菌体特征为:G(+),球状。

2.1.2乳酸菌DNA提取及16S rDNA扩增菌株DNA电泳图见图1所示,条带清晰,虽有DNA断裂的痕迹但仍可用于后续PCR扩增。对该DNA进行PCR扩增,PCR扩增产物通过凝胶电泳直接检测,电泳图见图2所示。由图2可知,PCR产物条带明亮清晰,条带长度为1400 bp左右,说明PCR扩增很成功,适合用于测序。

图1　 DNA电泳图Fig.1　DNA chart

图2　PCR扩增图Fig.2　PCR amplification chart

2.1.3乳酸菌同源性分析和系统发育树的构建由Mega6.0软件,绘制的系统发育树见图3所示。由图3可知,分离菌株S8与戊糖片球菌PediococcuspentosaceusDSM 20336的16S rDNA的同源性高达100%,且系统位置最接近,因此分离菌株鉴定为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。

图3　分离菌株系统发育树Fig.3　Phylogenetic tree of isolated strain

2.2分离菌株发酵特性研究

2.2.1分离菌株生长曲线及产酸特性分离菌株生长曲线如图4,由图可知,分离菌株在接种6 h后进入对数生长期,18 h左右进入平稳期。分离菌株产酸特性如图5所示,菌株在接种4 h后发酵物中总酸浓度逐渐升高;进入稳定期后,菌株发酵液中总酸仍有上升,说明该分离菌株符合发酵肉制品发酵剂的要求,可使环境pH下降,因此能抑制腐败菌的生长[9],提高产品的安全性。

图4　分离菌株生长曲线Fig.4　Growth curve of isolated strain

图5　分离菌株产酸曲线Fig.5　Production curve of isolated strain

2.2.2发酵温度对分离菌株生长代谢的影响温度对于菌株生长及产酸影响较大,由图6可知:环境温度从20～30 ℃,分离菌株的OD值与总酸逐渐升高,当温度高于30 ℃时,其OD值开始下降;当温度继续升高,菌株的生长及产酸能力受到极大的抑制,因此该分离菌株最适发酵温度为30 ℃。

图6　温度对分离菌株生长及产酸影响Fig.6　Temperature effect on growth and acid production of isolated strain

2.2.3发酵pH对分离菌株生长代谢的影响不同pH对菌株生长及产酸能力的影响程度不同,由图7可知:分离菌株在过酸或过碱情况下,生长能力受到抑制,其最适作用pH为5.5～6.0左右,而环境pH的改变对菌株产酸能力的影响不大,但在pH5.5时产酸量达到最大,为1.1958 g/100 mL,因此分离菌株的最适发酵pH为5.5。

2.2.4NaCl对分离菌株生长代谢的影响对NaCl的耐受能力是选择发酵肉制品发酵剂的一个重要因素,且筛选出的菌株要求能够至少在6%的食盐浓度下正常生长[2]。由图8可知:分离菌株对食盐有较好的耐受力,在盐浓度为0%～6%范围内OD值及总酸量变化不大,但在盐浓度大于6%(8%～10%)时,该菌株生长及产酸能力均有所下降却仍能生长,说明该分离菌株在肉制品发酵过程中有较强的竞争力,可作为肉制品的发酵剂。

表1　分离菌株氨基酸含量Table 1　Contents of free amino acids from strains

图7　pH对分离菌株生长及产酸的影响Fig.7　pH effect on growth and acid production of isolated strain

图8　NaCl浓度对分离菌株生长及产酸的影响Fig.8　NaCl concentration effect on growth and acid production of isolated strain

注:“-”表示未检测出,“*”表示必需氨基酸。

2.2.5亚硝酸盐对分离菌株生长代谢的影响国家规定亚硝酸钠在肉制品中的最大使用量是150 mg/kg,最大残留量不超过30 mg/kg,详见国标GB2762-2005和GB2760-2011。一般要求菌株至少在150 mg/kg的亚硝酸盐浓度下能良好的生长[10]。由图9可知:随着培养基中NaNO2浓度的增加分离菌株的生长及产酸能力大幅下降,当NaNO2浓度增加至150 mg/L时,该分离菌株生长能力明显下降,但该菌在此浓度下仍能生长,表明该分离菌株具有良好的亚硝酸盐耐受性,符合肉制品发酵剂的要求。

图9　NaNO2浓度对分离菌株生长及产酸的影响Fig.9　NaNO2 concentration effect on growth and acid production of isolated strain

2.3分离菌株发酵产物中氨基酸成分分析

对分离菌株发酵产物中的氨基酸成分进行测定,其计算结果见表1。由表1可知:菌株的发酵液中检测出了多种游离氨基酸,其总氨基酸量为0.95 mg/L,其中共含有5种人体必需氨基酸,占氨基酸总量的23.16%;在发酵肉制品中,乳酸菌的存在可大大促进蛋白质分解为游离氨基酸,分离菌株的代谢产物中必需氨基酸含量占总游离氨基酸量(实验组减去对照组的含量)较文献[1]高,因此将该分离菌株作为发酵肉制品的发酵剂不仅有利于增加发酵肉产品中的游离氨基酸含量,而且可使其风味更加浓郁。

3　结论

本文通过从四川传统发酵肉制品中分离筛选出一株优势乳酸菌,经16S rDNA测序及系统发育树构建,确定分离菌株为戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)。通过对分离菌株发酵特性研究,该分离菌株对数生长期为6～18 h;最适发酵温度30 ℃,发酵pH5.5;对NaCl及NaNO2耐受能力分别高达10%和150 mg/L;该菌株的代谢产物中含有多种游离氨基酸,其中必需氨基酸含量占氨基酸总量的23.16%。本研究数据表明该分离菌株适合作为传统发酵肉制品发酵剂,可为工业化实行纯菌种生产的发酵肉制品业提供菌种支持。

[1]刘洋.微生物发酵剂对四川腊肉特性影响研究[D].成都:西华大学,2014.

[2]马德功.发酵香肠中乳酸菌的分离、筛选及其应用[D].济南:山东轻工业学院,2008.

[3]李湘丽,袁廷香,闫吉美.乳酸菌在发酵香肠生产过程中的应用研究进展[J].食品与机械,2014,30(6):233-237.

[4]王卫,刘洋,王新惠,等.微生物发酵剂对四川腊肉可贮性和风味特性的影响[J].食品科技,2014,39(09):159-164.

[5]武俊瑞,王晓蕊,唐筱扬,等.辽宁传统发酵豆酱中乳酸菌及酵母菌分离鉴定[J].食品科学,2015,36(09):78-83.

[6]李欣,武俊瑞,田甜,等.大庆自然发酵酸菜中乳酸菌的分离鉴定及耐酸菌株初步筛选[J].食品科学,2014,35(01):150-154.

[7]崔春,彭睕睕,任娇艳,等. 米曲霉和乳酸菌混合制曲对小麦大曲制曲效果的影响[J].现代食品科技,2014,30(5):156-160.

[8]张璟琳,黄明泉,孙宝国,等.四大名醋的游离氨基酸组成成分分析[J].食品安全质量检测学报,2014,10(5):3124-3131.

[9]V.Biscola,S.D.Todorov,V.S.C Capuano,et al.Isolation and characterization of a nisin-like bacteriocin produced by aLactococcuslactisstrain isolated from charqui,a Brazilian fermented,salted and dried meat product[J].Meat Science,2013,(93):607-613.

[10]李凤彩,程文新,谢华,等. 发酵香肠菌种筛选标准探讨[J].食品科技,2002,23(6):78-79.

Study on the isolation of lactic acid bacteria from Sichuan traditional fermented meat and its fermentation characteristics

HUANG Dan1,LIU You-qing1,YU Hua1,MAO Xiang1,LIU Da-yu2,CHENG Hua1,WANG Li-quan1

(1.School of Biotechnology Engineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China；2.Sichuan Province Key Laboratory of meat processing,Chengdu 610106,China)

The dominant lactic acid bacteria was isolated and identified from Sichuan traditional fermented meat products and its fermentation characteristics were investigated. Using Sichuan Bacon as the research object,lactic acid bacteria were isolated and purified by plate marking method,and it was identified by 16S rDNA sequencing technique. Its growth metabolism and acid production capacity on the different temperature,pH,NaCl concentration,nitrite concentration and fermentation products of amino acid were researched. The results showed that the dominant lactic acid bacteria was screened and identifiedPediococcuspentosaceus. The logarithmic growth phase of strain was 6～18 h,the optimum fermentation temperature was 30 ℃,fermentation pH was 5.5,the strain also had good endurance abilities to the salt concentration 10% and the nitrite content 150 mg/L,and it could release 16 kinds of free amino acids,including 5 kinds of essential amino acids.

fermented meat;lactic acid bacteria;identification;fermentation characteristics;free amino acids

2015-07-09

黄丹(1968-),女,本科,教授,主要从事微生物及应用方面的研究,E-mail:huangdan3212006@126.com。

肉类加工四川省重点实验室重点项目(14-R02)；四川理工学院学科建设工程资助项目(2013TS13)。

TS251.1

A

1002-0306(2016)03-0149-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.023