肝爽颗粒对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用

杨素贞， 许绍娴， 董　蕾， 王　华， 商博鑫， 秦　斌

(西安交通大学第二附属医院消化内科，西安　710004； *通讯作者，E-mail:dong556@126.com)



肝爽颗粒对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用

杨素贞， 许绍娴， 董蕾*， 王华， 商博鑫， 秦斌

(西安交通大学第二附属医院消化内科，西安710004；*通讯作者，E-mail:dong556@126.com)

目的观察肝爽颗粒对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用，并探讨其可能的作用机制。 方法60只雄性SD大鼠，随机分为6组，正常组、模型组、多烯磷脂酰胆碱[71.25 mg/(kg·d)]阳性对照组、肝爽颗粒低剂量[117.19 mg/(kg·d)]组、中剂量[234.38 mg/(kg·d)]组和高剂量[468.75 mg/(kg·d)]组。正常组以基础饲料喂养。高脂饲料喂养10周建立非酒精性脂肪性肝炎模型，造模成功后，药物灌胃干预4周，模型组及正常组给予相应体积生理盐水，干预期间，各组大鼠均喂食基础饲料。ELISA试剂盒检测血清及肝脏组织甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)，血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)，肝脏组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等指标；肝脏组织石蜡切片，HE染色观察肝脏组织病理改变并做脂肪变性半定量分析。 结果与正常组比较，模型组血清AST、ALT、TC、TG,肝脏组织TC、TG、MDA均显著升高(P<0.05)，肝脏组织SOD显著降低(P<0.05)；与模型组比较，多烯磷脂酰胆碱阳性对照组和肝爽颗粒高剂量组血清AST、ALT、TC、TG，肝脏组织TC、TG、MDA均显著降低(P<0.05)，肝脏组织SOD显著升高(P<0.05)。与正常组比较，模型组肝脏HE染色可见肝细胞脂肪变性，脂肪浸润(P<0.05);与模型组比较，多烯磷脂酰胆碱阳性对照组和肝爽颗粒高剂量组肝脏脂肪变性程度显著减轻(P<0.05)。结论肝爽颗粒对高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝炎有治疗作用，其机制可能通过调节脂质代谢、减轻脂质过氧化损伤及氧化应激，改善肝脏功能及肝脏组织的病理变化，对大鼠非酒精性脂肪性肝炎发挥保护作用。

非酒精性脂肪性肝炎；肝爽颗粒；脂质过氧化；大鼠

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外明确的慢性肝病(病毒感染、自身免疫、遗传因素等)及酒精(饮酒量>20-30 g/d)原因引起的肝细胞损害，过量脂质在肝细胞沉积为主要特征的临床病理综合征，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)由其发展而来[1],已是全球性健康问题,在中国的发病率越来越高[2]。目前治疗方案包括生活方式干预、手术治疗和药物治疗，常用药物有吡格列酮、维生素E、他汀类及保肝药物等，然而对于其长期疗效和安全性仍有待进一步评估[3]。近年来中药治疗NAFLD受到关注，丹参、柴胡、虎杖等中药的疗效及作用机制已得到证实[4]。

肝爽颗粒是中药复方制剂，主要成分有丹参、柴胡(醋制)、白芍、当归、茯苓、白术(炒)、党参、鳖甲(烫)、蒲公英、虎杖、夏枯草、桃仁等，肝爽颗粒具有疏肝健脾，消热散瘀，保肝护肝，软坚散结。前期研究表明，肝爽颗粒对慢性病毒性肝炎、CCl4引起的肝损伤有一定治疗作用[5]，主要用于急慢性肝炎、肝硬化、肝功能损害的临床治疗。

本研究通过观察肝爽颗粒对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用，并探讨其可能的作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物

健康SPF级SD大鼠60只，雄性，体重(200±20)g，由西安交通大学医学部动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(陕)08-018。动物实验符合西安交通大学医学部动物实验中心管理委员会有关动物管理和使用规定。

1.2药品、饲料及试剂

肝爽颗粒由保定步长天浩制药有限公司提供；多烯磷脂酰胆碱胶囊由赛诺菲(北京)制药有限公司提供；高脂饲料、基础饲料均购自北京科澳协力饲料有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2014-0010；丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD) 测定ELISA试剂盒购自北京科盈美科技有限公司。

1.3动物模型的制备及给药方法

实验大鼠饲养于西安交通大学医学部动物实验中心，自由饮食饮水，12 h光照。基础饲料适应性喂养1周后随机分为6组：正常组、模型组、多烯磷脂酰胆碱阳性对照组、肝爽颗粒低、中、高剂量组，每组10只。模型组及各治疗组均喂食高脂饲料[6](胆固醇2%，胆酸钠0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，猪油10%，基础饲料82.3%)；正常组以基础饲料喂养，共10周。造模成功后，各组分别给予灌胃干预。肝爽颗粒低、中、高剂量干预组分别给予肝爽颗粒117.19 mg/(kg·d)，234.38 mg/(kg·d)，468.75 mg/(kg·d)，溶于生理盐水，0.1 g/ml;阳性对照组给予多烯磷脂酰胆碱71.25 mg/(kg·d)，溶于生理盐水，7.6 mg/ml;正常组及模型组分别给予相应体积的生理盐水。共干预4周，干预期间各组大鼠均喂食基础饲料。各组大鼠均在末次给药后禁饮食24 h，称重，10%水合氯醛3-4 ml/kg腹腔注射麻醉，常规开腹，腹主动脉取血，并经肝门迅速摘取肝脏。

1.4血清指标检测

ELISA试剂盒，根据说明书步骤检测血清中甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、天冬氨酸转氨酶 (AST)及丙氨酸转氨酶 (ALT)的含量。

1.5肝脏指标检测

肝指数=肝湿重/体重×100%。称取新鲜肝脏组织100 mg，按1∶9加异丙醇，用玻璃组织匀浆器制成10%的匀浆，低温离心提取上清液，ELISA试剂盒测定甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)含量；称取新鲜肝脏组织100 mg，加预冷生理盐水，用玻璃组织匀浆器制成10%的匀浆，低温离心提取上清液，ELISA试剂盒测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。所有操作均按照试剂盒要求进行。

1.6肝脏组织病理学观察

取相同部位的肝左叶组织1块，制备石蜡切片，HE染色并在光镜下观察肝脏组织病理改变，做脂肪变性的半定量分析。参考Brunt等[7]建议的脂肪病变标准，将光镜下观察到的肝脏脂肪性病变分为5个不同的等级，即-，+，++，+++，++++分别代表肝小叶内含脂滴细胞/总细胞为0，<1/3，1/3-2/3，>2/3，≈1。

1.7统计学分析

2　结果

2.1体重、肝湿重及肝指数的变化

与正常组比较，模型组肝湿重、肝指数均显著增加(P<0.05，见表1)。与模型组比较，阳性对照组及高剂量组肝湿重、肝指数均显著下降(P<0.05)，中、低剂量组肝湿重、肝指数虽有所下降，但无统计学差异(P>0.05)。与阳性对照组比较，高剂量组肝湿重、肝指数均无显著差异(P>0.05，见表1)。6组间体重未见显著差异。

组别n体重(g)肝湿重(g)肝指数(%)正常组10442.2±25.810.89±0.612.47±0.13模型组10456.0±16.012.29±0.62*2.70±0.05*肝爽颗粒低剂量组10459.7±7.812.04±0.472.61±0.07肝爽颗粒中剂量组10467.3±16.312.00±0.392.57±0.07肝爽颗粒高剂量组10458.7±22.811.44±0.42#2.49±0.11#多烯磷脂酰胆碱阳性对照组10464.8±30.611.39±0.87#2.45±0.08#

与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2血清AST、ALT、TC、TG 的变化

与正常组比较，模型组血清AST、ALT均明显升高(P<0.05，见表2)。与模型组比较，阳性对照组、高剂量组及中剂量组血清AST、ALT均显著下降(P<0.05)，低剂量组血清AST、ALT虽有下降，但无统计学差异(P>0.05)。与阳性对照组比较，高、中剂量组血清AST、ALT均无显著差异(P>0.05，见表2)。

与正常组比较，模型组血清TC、TG均明显升高(P<0.05，见表2)。与模型组比较，阳性对照组及高剂量组血清TC、TG均显著下降(P<0.05)，中、低剂量组血清TC、TG虽有下降，但无统计学差异(P>0.05)。与阳性对照组比较，高剂量组血清TC、TG均无显著差异(P>0.05，见表2)。

组别nAST(U/L)ALT(U/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常组10158.45±15.2466.67±4.621.41±0.480.56±0.15模型组10409.02±238.11*236.70±124.14*2.13±0.34*0.96±0.09*肝爽颗粒低剂量组10316.03±55.51172.67±18.851.93±0.120.88±0.10肝爽颗粒中剂量组10219.40±40.02#106.33±15.16#1.86±0.130.84±0.08肝爽颗粒高剂量组10160.87±67.81#70.51±21.01#1.55±0.22#0.68±0.10#多烯磷脂酰胆碱阳性对照组10174.05±135.98#88.82±84.29#1.66±0.31#0.66±0.07#

与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.3肝组织TC、TG、SOD、MDA的变化

与正常组比较，模型组肝组织匀浆TC、TG含量明显升高(P<0.05，见表3)。与模型组比较，阳性对照组及高剂量组肝组织匀浆TC、TG明显下降(P<0.05)，中、低剂量组肝组织TC、TG均有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。与阳性对照组比较，高剂量组肝组织匀浆TC、TG无显著差异(P>0.05，见表3)。

与正常组比较，模型组肝组织MDA明显升高(P<0.05，见表3)，SOD显著下降(P<0.05，见表3)。与模型组比较，阳性对照组及高剂量组肝组织MDA均显著下降(P<0.05)，SOD均明显升高(P<0.05)，中、低剂量组肝组织MDA下降，SOD升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。与阳性对照组比较，高剂量组肝组织SOD、MDA差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

2.4肝脏组织病理学检查

肉眼观察：正常组肝脏色泽鲜红，表面光滑，边缘锐利，质脆，触之易出血，大小、形态规则；模型组：肝脏呈黄色，表面及切面油腻，边缘圆钝，体积增大，重量增加，属典型肝细胞脂肪变性。与模型组比较，肝爽颗粒高剂量组及阳性对照组肝脏的色泽、体积和重量均有一定程度改善。

光镜下观察：正常组肝小叶结构规则，肝细胞排列整齐形成肝索，中央静脉位于肝小叶中间，肝细胞呈多边形，细胞核位于细胞中央且清晰可见，核大而圆，胞质红染，无空泡形成，无明显炎症反应(见图1)。模型组肝小叶轮廓欠清晰，肝细胞体积增大，肝索变粗，以中央静脉周围肝细胞较为明显，肝细胞胞质内出现大量脂滴空泡，细胞核位于细胞边缘，有少量中性粒细胞浸润(见图1)。与模型组比较，阳性对照组及肝爽颗粒高剂量组肝脏脂肪变性程度均有不同程度的改善，脂滴数量明显减少(见图1)。

表3各组大鼠肝脏组织匀浆中TC、TG、SOD、MDA的浓度比较

Table 3Comparison of contents of TC,TG,SOD and MDA in liver tissues among six groups

组别nTC(mmol/L)TG(mmol/L)SOD(U/ml)MDA(mmol/L)正常组101.03±0.080.80±0.091412.65±106.0365.14±3.19模型组102.71±1.40*1.40±0.30*1195.02±129.99*73.37±4.30*肝爽颗粒低剂量组102.66±0.511.14±0.261260.96±79.9672.55±6.88肝爽颗粒中剂量组102.51±0.521.13±0.181280.26±75.2969.72±3.20肝爽颗粒高剂量组101.52±0.41#0.82±0.30#1392.94±71.66#65.70±3.48#多烯磷脂酰胆碱阳性对照组101.75±0.55#0.96±0.31#1364.80±88.28#64.90±3.85#

与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

图1　各组大鼠肝脏组织病理变化 (HE染色，×200)Figure 1　The liver histological changes after different treatment (HE，×200)

正常组肝细胞均未见脂肪变性，而模型组肝细胞均有不同程度的脂肪变性，两者比较差异有统计学意义 (P<0.05，见表4)， 这表明造模成功。与模型组比较，阳性对照组及高剂量组脂变程度显著改善(P<0.05)，中、低剂量组脂变程度均有所减轻，但差异无统计学意义(P>0.05)。与阳性对照组比较，高剂量组脂变程度无显著差异(P>0.05，见表4)。

3　讨论

本实验采用高脂饲料喂养10周以复制非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型。预实验中，高脂饲料喂养10周后测大鼠肝功、血脂、肝脏组织HE染色，结果显示造模成功。生活方式干预仍为NAFLD的首选治疗方式[8]，故本实验造模成功药物干预期间，各组大鼠均给予基础饲料喂养。

表4各组大鼠肝细胞脂肪变性程度的比较

Table 4Comparison of fatty degeneration of liver cells among six groups

分组n肝细胞脂变程度-++++++++++正常组10100000模型组1001270肝爽颗粒低剂量组1012250肝爽颗粒中剂量组1011350肝爽颗粒高剂量组1024310多烯磷脂酰胆碱组1024400

各组大鼠肝细胞脂肪变性程度用Kruskal-Wallis 秩和检验，模型组与正常组比较，P<0.05;肝爽颗粒高剂量组和多烯磷脂酰胆碱组与模型组比较，P<0.05

NAFLD的发病机制尚未完全明确,目前较认同Day[9]提出的“二次打击学说”，第一次打击为胰岛素抵抗(IR)引起的脂肪在肝细胞内过量沉积，第二次打击是在肝细胞内脂质过量沉积的基础上的脂质过氧化，氧化应激和一些细胞因子参与的炎症反应引起的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[10]。

NASH通常与代谢紊乱如血脂异常有关[11]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血清TG、TC明显升高，符合脂质代谢异常的表现；肝爽颗粒干预后，大鼠血清TG、TC水平均较模型组明显减低，与阳性对照组无明显差异。提示肝爽颗粒可改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂质代谢异常作用。

丙氨酸氨基转移酶(ALT)及门冬氨酸氨基转移酶(AST)通常存在于肝细胞内，当肝细胞损伤时破裂入血，是常用的反映肝细胞损伤的酶学指标。本研究结果显示，与正常组比较，模型组血清ALT、AST水平明显升高，提示存在肝脏功能损害；肝爽颗粒治疗后，大鼠血清AST、ALT水平较模型组显著降低，提示肝爽颗粒可有效改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝功能，减轻肝细胞损伤。

组织学检测肝脏脂肪变性是NAFLD的诊断标准，也是病变进展及疗效评价的依据[12]。本研究结果显示，与正常组比较，模型组肝组织病理学显示有不同程度的脂肪浸润，肝小叶轮廓欠清晰，肝细胞体积增大，肝索变粗，以中央静脉周围肝细胞较为明显，肝细胞胞质内出现大量脂滴空泡，细胞核位于细胞边缘，有少量中性粒细胞浸润，符合NAFLD大鼠肝脏病理表现。肝爽颗粒治疗后，肝脏脂肪变性程度均有不同程度的改善，脂滴数量减少，与多烯磷脂酰胆碱阳性药物对照组无明显差异，提示肝爽颗粒可有效改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏病理改变。

氧化应激是因为氧化物和抗氧化剂间平衡失调，氧化物产生过多，氧化物的主要来源是线粒体产生的反应性氧(ROS)，超过超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、维生素E等组成的抗氧化系统的清除能力，导致需氧细胞损伤。过量脂质在肝细胞内沉积，肝摄取脂肪酸过量，产生大量的ROS，可通过电子传递直接氧化细胞大分子物质，破坏细胞功能及其完整性，损伤线粒体并导致呼吸链功能障碍，从而产生更多的 ROS，使脂质过氧化进一步加重，又进一步干扰肝内脂类代谢，形成恶性循环。丙二醛(MDA)作为脂质过氧化的最终产物, 可阻断呼吸链中电子的转运,其含量可反映机体内脂质过氧化的程度。超氧化物歧化酶(SOD)作为保护机体的抗氧化剂, 可清除氧自由基,、脂质过氧化产物, 减轻脂质过氧化进程，局部提高SOD活性可以有效地预防NAFLD的进一步发展[13,14]。故通过检测肝脏组织匀浆中MDA及SOD的含量，可反映肝细胞脂质过氧化及氧化应激的严重程度。研究结果显示，与正常组比较，模型组肝脏组织匀浆中MDA明显升高，SOD明显降低，说明NASH大鼠存在脂质过氧化。肝爽颗粒及多烯磷脂酰胆碱治疗后能够显著增加肝脏组织SOD含量，并显著降低MDA含量。故肝爽颗粒可能通过增强体内的抗氧化剂活性，减轻脂质过氧化作用，对非酒精性脂肪性肝炎大鼠起到一定保护作用。

药理学研究证明，丹参有效成分丹参酮和总酚酸具有清除氧自由基和抗脂质过氧化的作用，可通过增强过氧化物酶体增殖物激活受体的表达，有效逆转高脂饮食所致的肝脂肪变性和炎症改变，并能抑制内源性胆固醇的合成，从而达到治疗NAFLD的作用[15]；柴胡有效成分柴胡皂苷能降低NAFLD大鼠TG水平，减少脂质沉积，增加肝组织SOD含量[16]，从而达到抗氧化目的，所以肝爽颗粒中多成分通过多途径参与NAFLD的治疗。

本研究中，肝爽颗粒能改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝脏功能、脂质代谢紊乱及肝脂肪变性，减轻脂质过氧化及氧化应激水平，这些治疗效果可能与上述作用机制相关。但复方中各组分的作用特点不能体现和/或代表肝爽颗粒的全部作用及特点；具体作用机制有待进一步研究。

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Ganshuang granules alleviates non-alcoholic steatohepatitis in rats

YANG Suzhen,XU Shaoxian,DONG Lei,WANG Hua,SHANG Boxin,QIN Bin

(DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:dong556@126.com)

ObjectiveTo evaluate the therapeutic effect of Ganshuang granules on non-alcoholic steatohepatitis in rats.MethodsSixty male Sprague-Dawley rats were divided into six groups randomly(n=10 in each group): normal group, model group, polyene-phosphatidylcholine[71.25 mg/(kg·d)](positive control group), Ganshuang granules low dose[117.19 mg/(kg·d)] group, moderate dose[234.38 mg/(kg·d)] group and high dose[468.75mg/(kg·d)] group.The non-alcoholic steatohepatitis model was established by giving high-fat diet for 10 weeks. During the administration of drugs, all the rats were fed with basic diet. The levels of triglyceride(TG), cholesterol(TC), alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST) in serum,and triglyceride(TG), cholesterol(TC), malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase(SOD) in liver tissues were detected by ELISA.HE staining was used for microscopic liver steatosis scoring.ResultsCompared with normal group，levels of AST,ALT,TC,TG in serum and TC,TG,MDA in liver tissues were significantly increased in model group(P<0.05)，while the content of SOD in liver tissue was decreased(P<0.05). Compared with model group, levels of AST, ALT, TC, TG in serum as well as TC,TG,MDA in liver tissues were decreased in positive control group and high dose group(P<0.05)，while SOD in liver tissue was increased(P<0.05). HE staining showed that the degree of steatosis in liver tissues was improved obviously in Ganshuang granules high dose group and positive control group(P<0.05).ConclusionGanshuang granules could have the protective effect on high-lipid diet-induced non-alcoholic steatohepatitis by ameliorating the oxidative injury, and improving the liver function and pathology in rats.

non-alcoholic steatohepatitis;Ganshuang granules;lipid peroxidation;rats

国家星火计划项目子课题资助项目(2011GAB50001);“十二·五”国家科技支撑计划子课题资助项目(2012BAJl8B03-03)

杨素贞，女，1989-12生，在读硕士，E-mail：18191768066@163.com

2015-11-25

R575

A

1007-6611(2016)03-0205-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.003