miR-139对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

李志全， 马　龙， 董　晖， 黎　璞， 吴尧平*

(1第四军医大学西京医院骨科，西安　710032； 2解放军第513医院心内科； 3解放军第474医院骨科； 4第四军医大学唐都医院麻醉科； *通讯作者，E-mail：fmmuxj_wuyp@sina.com)



miR-139对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

李志全1， 马龙2， 董晖3， 黎璞4， 吴尧平1*

(1第四军医大学西京医院骨科，西安710032；2解放军第513医院心内科；3解放军第474医院骨科；4第四军医大学唐都医院麻醉科；*通讯作者，E-mail：fmmuxj_wuyp@sina.com)

目的阐明miR-139在骨肉瘤细胞中的表达水平及其对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。 方法采用qRT-PCR检测miR-139在永生化成骨细胞系hFOB 1.19及骨肉瘤细胞系SOSP-9607、MG-63中的表达情况；采用5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和曲古抑菌素A(TSA)处理骨肉瘤细胞，通过qRT-PCR检测miR-139的表达变化；将miR-139模拟物转染入骨肉瘤细胞中，通过MTT实验检测细胞增殖能力的变化，通过流式细胞术分析细胞凋亡的变化，通过Western blot检测Cyclin D1表达和Caspase-3活化的变化。 结果与永生化成骨细胞系hFOB 1.19相比，miR-139在SOSP-9607和MG-63骨肉瘤细胞中的表达水平显著降低(P<0.01)；5-Aza-CdR对SOSP-9607和MG-63骨肉瘤细胞中miR-139的表达没有影响，而TSA能够促进miR-139的表达(P<0.01)；miR-139模拟物能够抑制骨肉瘤细胞的增殖能力，诱导骨肉瘤细胞凋亡，并抑制Cyclin D1的表达、促进Caspase-3的激活(P<0.05或P<0.01)。 结论miR-139在骨肉瘤细胞中低表达，而过表达miR-139能够抑制骨肉瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。

骨肉瘤；miR-139；增殖；凋亡

骨肉瘤(osteosarcoma)是最常见的恶性骨肿瘤，起源于间质细胞，好发于儿童及青少年，肿瘤早期即可发生远处转移。20世纪70年代以前，骨肉瘤的标准治疗方案是截肢术，患者5年生存率不足20%。随着化疗方案和技术的不断进步，化疗联合保肢手术已成为骨肉瘤的标准治疗方案，非转移性骨肉瘤患者的5年生存率已提高至65%-70%。但是，对于恶性程度较高或者已经发生远处转移的骨肉瘤患者，近几十年来其生存率并没有显著提高，中位生存期仅为23个月，其主要原因是骨肉瘤细胞容易对化疗药物产生多药耐药性(multidrug resistance，MDR)，从而导致化疗效果不明显[1]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是由18-25个碱基组成的非编码小分子RNA，能够通过种子序列(seed sequence)识别靶基因mRNA的3′端非翻译区(3′-untranslated region，3′-UTR)，与之发生完全或不完全的碱基配对结合，进而导致靶基因mRNA的降解或抑制其翻译，因此，miRNA能够从转录后水平调控基因的表达。迄今为止，通过生物信息学及实验研究已在人体组织细胞中鉴定出了1 000多个miRNA分子，每个miRNA分子能够调控多个基因的表达，而每个基因也可能受到多个miRNA分子的调控。目前的研究表明，大约50%的人类基因表达受到miRNA的调控。miRNA的碱基序列在种间具有高度保守性，其在细胞分化、代谢、增殖和凋亡等生命活动过程中扮演重要角色，广泛参与了多种生理及病理过程[2]。

高杰等[3]最先研究了骨肉瘤的miRNA表达谱，从SOSP-9607骨肉瘤细胞中鉴定得到了182个miRNA分子。迄今已有大量研究证实，骨肉瘤组织细胞中存在多种miRNA分子的异常表达，其与骨肉瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及耐药性等多种恶性表型相关[4]。miR-139是近几年新发现的一种具有抑癌作用的miRNA分子，其在多种肿瘤细胞中表达降低，而过表达miR-139能够抑制肿瘤细胞的恶性表型，但目前有关miR-139与骨肉瘤的相关性尚未见报道[5]。因此，本研究将检测miR-139在骨肉瘤细胞中的表达情况，观察其对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响，初步探索miR-139在骨肉瘤形成及发展过程中的作用，为骨肉瘤的临床诊断及治疗提供实验参考。

1　材料和方法

1.1主要仪器

CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；NanoDrop ND-000分光光度计(NanoDrop Tech，美国)；ABI7500 Fast实时定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)；蛋白电泳仪、iMark酶标仪(Bio-Rad，美国)；FACSCalibur 流式细胞仪(BD Biosciences，美国)；FluorChem FC2凝胶成像系统(Alpha Innotech，美国)。

1.2主要试剂

RPMI1640培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(HyClone，美国)；青-链霉素溶液(100×)、胰酶细胞消化液(上海碧云天生物技术有限公司)；总RNA提取试剂盒miRNeasy Mini Kit、miRNA反转录与实时定量PCR试剂盒miScript PCR Starter Kit(Qiagen，德国)；组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)、DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(Sigma，美国)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；siRNA-Mate转染试剂(上海吉玛制药技术有限公司)；抗Cyclin D1、活化Caspase-3及β-actin抗体(Abcam，英国)；BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒(Pierce，美国)。

1.3细胞培养

永生化成骨细胞系hFOB 1.19、骨肉瘤细胞系SOSP-9607及MG-63由本室保存。细胞接种于培养皿中，加入适量含10%胎牛血清、1%青-链霉素的RPMI1640培养基，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，常规胰酶消化传代。

1.4实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)

采用miRNeasy Mini Kit提取细胞总RNA，定量后采用miScript PCR Starter Kit进行qRT-PCR，以U6为内参。miR-139的上游引物序列为：5′-TCT ACA GTG CAC GTG TCT-3′，下游引物为试剂盒中的通用引物。U6的上游引物序列为：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物序列为：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.5细胞转染实验

miR-139模拟物(mimics)及阴性对照(negative control)由上海吉玛制药技术有限公司合成。细胞转染步骤参考siRNA-Mate说明书，简要步骤如下：转染前一天接种细胞至6孔板，待第2天细胞生长至约30%汇合度时进行转染。采用无血清RPMI1640培养基分别稀释siRNA-Mate和miRNA(二者比例为1 μl siRNA-Mate对应10 pmol miRNA)，静置5 min后将二者混匀，室温孵育20 min后加入培养孔中，miRNA终浓度为40 nmol/L。

1.6MTT实验检测细胞增殖能力

胰酶消化、离心收集骨肉瘤细胞，血球计数板计数后调整细胞密度至2×104/ml。随后将细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μl(即2×103/孔)。待细胞贴壁后(接种后12 h)开始计时，分别于0，1，2，3，4，5 d向每孔中加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续孵育4 h，每孔中再加入100 μl Formanzan溶解液并继续孵育，直至普通光学显微镜下显示Formanzan结晶全部溶解为止(约4 h)，于570 nm波长处测定OD值。1.7流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡

分别收集处理后的SOSP-9607及MG-63骨肉瘤细胞(包括培养液中的细胞)，PBS重悬细胞并计数。取1×105个重悬细胞，1 000×g离心5 min后弃上清，加入195 μl Annexin Ⅴ-FITC结合液轻轻重悬细胞，然后加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC，轻轻混匀，再加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀。室温避光孵育20 min，进行流式细胞术检测细胞凋亡状况。

1.8Western blot实验检测蛋白表达

收集处理后的SOSP-9607及MG-63骨肉瘤细胞，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒定量。制备蛋白电泳样品，SDS-PAGE电泳后转膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入TBST稀释的抗Cyclin D1、活化Caspase-3或β-actin抗体，4 ℃孵育过夜。次日洗涤一抗后加入相应的二抗，室温孵育2 h，洗涤后采用ECL试剂盒进行化学发光，利用FluorChem FC2系统成像并进行灰度分析。

1.9统计学分析

2　结果

2.1miR-139在骨肉瘤细胞中的表达变化

miR-139在多种肿瘤细胞中的表达降低，但在骨肉瘤细胞中的表达变化未见研究报道。为此，首先采用qRT-PCR检测了miR-139在永生化成骨细胞系hFOB 1.19及骨肉瘤细胞系SOSP-9607、MG-63中的表达情况。结果发现：与永生化成骨细胞系hFOB 1.19相比，miR-139在SOSP-9607和MG-63骨肉瘤细胞中的表达水平显著降低，分别为hFOB 1.19细胞的42%±11%(P<0.01)和18%±4%(P<0.001，见图1)。

2.2miR-139在骨肉瘤细胞中表达变化的调控机制

上述qRT-PCR结果表明,miR-139在骨肉瘤细胞中的表达明显下降，为进一步揭示miR-139表达降低的原因，采用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理骨肉瘤细胞，通过qRT-PCR检测miR-139的表达变化。以DMSO为对照，分别用5 μmol/L的5-Aza-CdR和200nmol/L的TSA处理hFOB 1.19、SOSP-9607、MG-63细胞72 h，提取总RNA后进行qRT-PCR。结果发现：5-Aza-CdR和TSA对hFOB 1.19细胞中miR-139的表达没有显著影响(P>0.05)，5-Aza-CdR对SOSP-9607和MG-63细胞中miR-139的表达也没有显著影响(P>0.05)，但TSA能够显著促进SOSP-9607和MG-63细胞中miR-139的表达(P<0.01或P<0.001，见图2)。

与hFOB 1.19细胞比较，*P<0.01，**P<0.001图1　qRT-PCR检测miR-139在骨肉瘤细胞中的表达Figure 1　Expression of miR-139 in osteosarcoma cells detected by qRT-PCR

与DMSO对照组比较，*P<0.01，**P<0.001图2　5-Aza-CdR和TSA 对骨肉瘤细胞中miR-139表达的影响Figure 2　The effect of 5-Aza-CdR and TSA on miR-139 expression in osteosarcoma cells

2.3转染miR-139模拟物对骨肉瘤细胞增殖的影响

miR-139是一种具有抑癌作用的miRNA分子[5]。为证实miR-139是否能够抑制骨肉瘤细胞的增殖，我们合成了miR-139模拟物(mimics)，将其转染入骨肉瘤细胞中，通过MTT实验检测细胞增殖能力的变化。与转染阴性对照(negative control)相比，转染miR-139模拟物能够显著抑制骨肉瘤细胞SOSP-9607的增殖能力(P<0.05，见图3A)，第3,4,5天的抑制率分别为28.9%±13.2%,32.7%±9.1%,29.3%±12.1%。转染miR-139模拟物同样显著抑制了MG-63细胞的增殖能力(P<0.01，见图3B)，第3，4，5天的抑制率分别为41.7%±8.3%，37.3%±8.5%，39.1%±6.3%。

与阴性对照比较，*P<0.05　　　　　　　　　　与阴性对照比较，**P<0.01　　　　　　　　　A.SOSP-9607细胞　　　　　　　　　　　　　　B.MG-63细胞图3　miR-139对骨肉瘤细胞增殖的影响Figure 3　The effect of miR-139 on osteosarcoma cell proliferation

2.4转染miR-139模拟物对骨肉瘤细胞凋亡的影响

为分析miR-139是否能够诱导骨肉瘤细胞凋亡，将miR-139模拟物转染入骨肉瘤细胞中，转染后72 h收集细胞，经Annexin Ⅴ-FITC/PI染色后，通过流式细胞术检测细胞凋亡。结果发现：与阴性对照转染组比较，转染miR-139模拟物能够诱导SOSP-9607和MG-63细胞的凋亡，二者凋亡率分别为8.66%±3.12%和13.3%±2.77%(见图4)，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01或P<0.001，见图5)。

图4　SOSP-9607和MG-63细胞的 FCM检测结果Figure 4　The FCM results of SOSP-9607 and MG-63 cell apoptosis

与阴性对照组比较，*P<0.01，**P<0.001图5　FCM检测结果的统计分析Figure 5　The statistical analysis of FCM results

2.5转染miR-139模拟物对骨肉瘤细胞Cyclin D1表达和Caspase-3活化的影响

前述结果表明miR-139能够抑制骨肉瘤细胞增殖，并诱导其凋亡。为进一步分析miR-139生物学作用的分子机制，采用Western blot检测了miR-139对骨肉瘤细胞中细胞周期素Cyclin D1表达和Caspase-3活化的影响。结果发现：转染后72 h，与阴性对照转染组相比，miR-139模拟物导致SOSP-9607和MG-63细胞中Cyclin D1的表达下降，而活化Caspase-3的表达升高(见图6)。

1.SOSP-9607细胞阴性对照组；2.SOSP-9607细胞实验组；3.MG-63细胞阴性对照组；4.MG-63细胞实验组图6　miR-139对骨肉瘤细胞Cyclin D1和活化Caspase-3表达的影响Figure 6　The effect of miR-139 on Cyclin D1 and active Caspase-3 expression in osteosarcoma cells

3　讨论

miRNA与肿瘤的发生发展紧密相关，既可扮演癌基因的角色，也可扮演抑癌基因的角色，其在肿瘤组织细胞中的表达变化特征对于肿瘤诊断、治疗及预后评估具有重要的参考价值[2]。miR-139是近年新发现的一种抑癌miRNA分子，基因定位于染色体11q13.4。miR-139在肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、食管鳞癌、非小细胞肺癌、胶质瘤等多种肿瘤细胞中表达降低，同时证实过表达miR-139能够抑制这些肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学表型[5]。尽管已有许多研究证实miR-139作为抑癌基因参与了多种肿瘤的病理进程，但迄今尚无miR-139与骨肉瘤相关性的研究报道。因此，本研究以永生化成骨细胞系hFOB 1.19、骨肉瘤细胞系SOSP-9607及MG-63为研究对象，首先采用qRT-PCR分析了这三种细胞中miR-139的表达状况，结果发现与永生化成骨细胞系hFOB 1.19相比较，miR-139在SOSP-9607和MG-63骨肉瘤细胞中的表达明显下降，这提示miR-139可能参与了骨肉瘤的发生发展。

miRNA的编码序列多位于蛋白质编码基因的内含子区，因而常与其宿主基因共表达，但有研究表明miR-139具有独立的启动子，不仅与其宿主基因PDE2A的表达缺乏相关性，而且具有与宿主基因相反的生物学功能[6,7]。miRNA基因的表观遗传学修饰与其表达状况紧密相关，而DNA的甲基化修饰和组蛋白的乙酰化修饰是最常见的两种表观遗传学修饰方式，前者抑制基因表达而后者促进基因表达[8]。为揭示骨肉瘤细胞中miR-139表达降低与表观遗传学修饰的相关性，本研究采用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA分别处理永生化成骨细胞系hFOB 1.19、骨肉瘤细胞系SOSP-9607及MG-63，通过qRT-PCR检测miR-139的表达变化，结果证实骨肉瘤细胞中miR-139的低表达与DNA的甲基化修饰无关，但与组蛋白的去乙酰化修饰相关。在胃癌、结肠癌等其他肿瘤细胞中的研究同样证实miR-139的表达水平与组蛋白的去乙酰化修饰密切相关[6,7]。

作为抑癌miRNA分子，许多研究结果表明过表达外源性miR-139能够抑制肿瘤细胞的增殖能力，并可以诱导肿瘤细胞的凋亡[5]。本研究初步探索了miR-139对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的作用，与其他肿瘤中的研究结果类似，发现转染化学合成的miR-139模拟物能够显著抑制骨肉瘤细胞SOSP-9607、MG-63的增殖，并能够诱导其凋亡。细胞周期素Cyclin D1是调控细胞周期G1期的关键蛋白，对细胞周期调控至关重要。大量研究表明，Cyclin D1在多种肿瘤组织细胞中存在过表达，可作为癌基因促进肿瘤的发生发展[9]。不同刺激因素导致的细胞凋亡过程主要由三条通路执行，包括线粒体通路或内源性通路、死亡受体通路或外源性通路、内质网应激通路，其中Caspase-3是所有通路共同的关键执行蛋白[10]。因此，为揭示miR-139抑制骨肉瘤细胞增殖及诱导凋亡的机制，本研究采用Western blot分析了miR-139对骨肉瘤细胞中Cyclin D1表达和Caspase-3活化的影响，结果证实miR-139能够抑制Cyclin D1表达，并诱导Procaspase-3剪切以形成活化型Caspase-3。

综上所述，本研究发现miR-139在骨肉瘤细胞中呈低表达状态，这种低表达与DNA的甲基化修饰无关，而是由组蛋白的去乙酰化导致的。过表达外源性miR-139能够通过下调Cyclin D1的表达而抑制骨肉瘤细胞增殖，同时能够通过激活Caspase-3而诱导骨肉瘤细胞凋亡。

[1]Isakoff MS,Bielack SS,Meltzer P,etal.Osteosarcoma: Current treatment and a collaborative pathway to success[J].J Clin Oncol,2015,33(27):3029-3035.

[2]Hammond SM.An overview of microRNAs[J].Adv Drug Deliv Rev,2015,87:3-14.

[3]高杰，杨彤涛，裘秀春，等.成骨肉瘤细胞SOSP-9607中miRNA的克隆与验证[J].癌症，2007，26(6):561-565.

[4]Sampson VB,Yoo S,Kumar A,etal.MicroRNAs and potential targets in osteosarcoma:Review[J].Front Pediatr,2015,3:69.

[5]Zhang HD,Jiang LH,Sun DW,etal.MiR-139-5p:promising biomarker for cancer[J].Tumour Biol,2015,36(3):1355-1365.

[6]Bao W,Fu HJ,Xie QS,etal.HER2 interacts with CD44 to up-regulate CXCR4 via epigenetic silencing of microRNA-139 in gastric cancer cells[J].Gastroenterology,2011,141(6):2076-2087.

[7]Shen K,Mao R,Ma L,etal.Post-transcriptional regulation of the tumor suppressor miR-139-5p and a network of miR-139-5p-mediated mRNA interactions in colorectal cancer[J].FEBS J,2014,281(16):3609-3624.

[8]Tuna M,Machado AS,Calin GA.Genetic and epigenetic alterations of microRNAs and implications for human cancers and other diseases[J].Genes Chromosomes Cancer,2015：Epub ahead of print.

[9]Musgrove EA,Caldon CE,Barraclough J,etal.Cyclin D as a therapeutic target in cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,11(8):558-572.

[10]Zeng W,Wang X,Xu P,etal.Molecular imaging of apoptosis:from micro to macro[J].Theranostics,2015,5(6):559-582.

Effects of miR-139 on osteosarcoma cell proliferation and apoptosis

LI Zhiquan1, MA Long2, DONG Hui3, LI Pu4, WU Yaoping1*

(1DepartmentofOrthopedics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofCardiology, 513thHospitalofChinesePLA;3DepartmentofOrthopedics, 474thHospitalofChinesePLA;4DepartmentofAnesthesiology,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:fmmuxj_wuyp@sina.com)

ObjectiveTo clarify the expression level of miR-139 in human osteosarcoma cells and its effects on osteosarcoma cell proliferation and apoptosis.MethodsThe expression of miR-139 was detected by qRT-PCR in immortalized osteoblast cell line hFOB 1.19 and osteosarcoma cell lines SOSP-9607 and MG-63. Osteosarcoma cells were treated with 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-CdR) and trichostatin A(TSA), and then miR-139 expression was detected by qRT-PCR. After miR-139 mimics was transfected into osteosarcoma cells, the cell proliferation ability, cell apoptosis rate, Cyclin D1 and active Caspase-3 expression were detected by MTT assay, flow cytometry and Western blot, respectively.ResultsCompared with hFOB 1.19 cells, miR-139 expression was significantly reduced in SOSP-9607 and MG-63 osteosarcoma cells(P<0.01). The expression of miR-139 was not affected by 5-Aza-CdR in SOSP-9607 and MG-63 osteosarcoma cells, while TSA promoted the expression of miR-139 in these cells(P<0.01). The miR-139 mimics was capable of inhibiting the proliferation, inducing cell apoptosis, suppressing Cyclin D1 expression, and promoting the activation of Caspase-3 in SOSP-9607 and MG-63 osteosarcoma cells(P<0.05 orP<0.01).ConclusionThe expression of miR-139 is downregulated in human osteosarcoma cells and its overexpression can inhibit osteosarcoma cell proliferation and induce apoptosis.

osteosarcoma;miR-139;proliferation;apoptosis

陕西省自然科学基础研究计划资助项目(2014JM4120)

李志全，男，1976-06生，博士，主治医师，E-mail：fmmuxj_wuyp@sina.com

2015-12-21

R738

A

1007-6611(2016)03-0232-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.009