三维培养人牙髓细胞细胞增殖能力的研究

翟莎菲， 蒋文凯， 倪龙兴*

(1西安医学院口腔医学系，西安　710021； 2第四军医大学口腔医学院； *通讯作者，E-mail：Longxing_Ni@hotmail.com； #共同通讯作者，E-mail：zhaishafei@xiyi.edu.cn)



三维培养人牙髓细胞细胞增殖能力的研究

翟莎菲1#， 蒋文凯2， 倪龙兴2*

(1西安医学院口腔医学系，西安710021；2第四军医大学口腔医学院；*通讯作者，E-mail：Longxing_Ni@hotmail.com；#共同通讯作者，E-mail：zhaishafei@xiyi.edu.cn)

目的检测普通贴壁培养和三维培养的牙髓细胞在一定时间的增殖能力。方法用U底铺有琼脂糖的96孔板作为非黏附表面，每孔接种104个牙髓细胞形成三维培养体系，诱使牙髓细胞发生 nemosis。以普通贴壁培养牙髓细胞作为对照组，分别在细胞接种20，40，60，80 h加入CCK8试剂，450 nm校正波长测量光密度(OD)值。 结果随着培养时间的延长，普通贴壁培养牙髓细胞OD值逐渐增多；三维培养不同时间点的OD值不同，其中三维培养20-60 h OD值变化不大，80 h较60 h OD值显著减少；并且在不同的时间点，三维培养的牙髓细胞的OD值均小于普通贴壁培养的牙髓细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论随着培养时间的延长，三维培养的牙髓细胞细胞增殖能力均小于贴壁培养的牙髓细胞。

牙髓细胞；三维培养；增殖活力；nemosis

牙髓成纤维细胞是牙髓组织的主体细胞，因此又被称为牙髓细胞。以往的研究认为牙髓细胞负责合成胞外基质，近年越来越多的研究发现牙髓细胞在牙髓组织免疫反应以及牙髓炎的发生发展中扮演重要的角色[1,2]，但牙髓细胞参与牙髓炎症的免疫防御机制尚不清楚。近年来，一种被称为“nemosis”的发生在成纤维细胞上的细胞激活形式被国内外研究所发现。Bizik等[3]发现利用三维培养的方法使得成纤维细胞之间形成紧密接触，能使其激活，随着自发性地释放一系列的细胞因子，如促炎因子(IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF)和趋化因子(MIP-1α、RANTES、IL-8)，与此同时，成纤维细胞自身逐渐开始发生坏死，具有程序性坏死的特征，因此取名“nemosis”，希腊语意为“不可避免的报复”[3-6]。利用体外三维培养使得成纤维细胞自发性激活nemosis，可能为研究炎症发生和保持以及炎症相关致癌作用提供新思路[5]。迄今为止，发生nemosis的细胞研究发现的有包皮成纤维细胞、皮肤成纤维细胞等，但牙髓成纤维细胞能否发生nemosis，有何自有的特征，至今研究很少[4,7]。本实验比较研究牙髓细胞增殖能力在非黏附不贴壁的三维培养体系中和普通贴壁培养体系中有何不同，为下一步搞清nemosis这种炎性细胞死亡在牙髓炎中的作用奠定实验基础。

1　材料和方法

1.1主要试剂和仪器

α-MEM培养液(Gibico，美国)；胎牛血清(Sigma，美国)；胰蛋白酶(Invitrogen，美国)；青霉素、链霉素(Invitrogen，美国)；琼脂糖(BioWhittaker，美国)；CCK-8试剂(DOJINDO，日本)；酶标仪(Bio-Tek，美国)。

1.2人牙髓细胞的体外培养

实验经西安医学院医学伦理委员会审核批准，经患者知情同意，取第四军医大学口腔医院颌外门诊拔除的健康(无龋坏、牙髓炎或牙周炎)第三磨牙，患者年龄15-25岁，参照文献[8]方法，用含双抗的PBS液反复清洗牙齿后，无菌条件下分离牙髓，根尖1/3部分剪弃，剩余牙髓剪成约1.0 mm3的碎块，平铺于孔板底壁滴加有500 μl含20%胎牛血清、100 U /ml青霉素、100 μg/ml链霉素的α-MEM培养液的6孔板内，用无菌盖玻片小心覆盖组织块使之固定，缓慢轻轻加入上述培养液2 ml，置培养箱中37 ℃、5% CO2的孵箱中培养,每3 d换液1次，待细胞生长会合后，20 g/L胰蛋白酶消化原代细胞，按1∶3传代，取4-6代细胞用于后述实验。

1.3牙髓细胞的三维培养及形态观察

蒸馏水配制0.8%的琼脂糖溶液，高压灭菌后铺于U形底的96孔板形成非黏附表面。20 g/L胰蛋白酶消化牙髓细胞，用含10%胎牛血清的α-MEM制备5×104/ml的细胞悬液，接种于U形96孔板，每孔200 μl，置培养箱中37 ℃、5% CO2的孵箱,倒置显微镜观察细胞形态。

1.4牙髓细胞增殖能力检测

消化牙髓细胞，细胞计数后等量接种于平底96孔板和U型底96孔板，每组5个复孔。分别于细胞接种的20，40，60，80 h加入待检测孔，每孔加入细胞培养液1/10体积的CCK8试剂，37 ℃、5% CO2培养1 h，酶标仪450 nm测量波长，650 nm校正波长测吸光度(OD)值。实验重复3次。

1.5统计学分析

2　结果

2.1三维培养牙髓细胞形态

三维培养的牙髓细胞2 h即可发现细胞开始聚集，12 h时细胞和细胞之间距离更近，20 h左右即可形成类似“球体”，细胞球体内细胞之间连接紧密，普通的方法甚至胰酶都很难使其解体，大约48 h后细胞球体体积进一步缩小，与此同时球体周围可见细胞碎片残骸。

图1　光镜下三维培养40 h牙髓细胞(×40)Figure 1　Dental pulp cells morphology in three-dimensional culture at 40 h under optical microscope

2.2牙髓细胞胞膜损伤检测

CCK8实验的结果见图2，实验所测的光密度值的大小代表细胞数目多少。随着培养时间的延长，普通贴壁培养牙髓细胞OD值逐渐增多；而三维培养20，40，60，80 h不同时间点的OD值有差异(P=0.042)，其中20 h，40 h，60 h OD值变化不大，80 h较60 h OD值显著减少，差异具有统计学意义(P=0.006)。

与普通贴壁比较，*P<0.05;与60 h比较，#P<0.05图2　贴壁培养和三维培养的牙髓细胞细胞增殖能力Figure 2　Comparison of dental pulp cells proliferation abilities between three-dimensional culture and normal adherent culture

3　讨论

CCK8试验是一种检测细胞存活和生长的方法。CCK8试剂通过测量细胞代谢体现细胞活力，检验细胞增殖能力。CCK8试剂中含有WST-8，其能通过电子载体的作用进入细胞，经过线粒体的脱氢酶还原反应生成黄色甲臜染料，生成甲臜染料的数量和活细胞的数量呈正比，染料是水溶性的，因此不需要裂解细胞，因此可直接比色检测，用于细胞增殖的检测。传统的检测细胞生长所用的显色剂是四唑盐，商品名是噻唑蓝，简称为MTT。MTT法检测原理是：活细胞线粒体中存在琥珀酸脱氢酶，因此能使外源性的MTT还原为不溶性的甲臜蓝紫色结晶物，进而沉积在细胞中。而死细胞不存在琥珀酸脱氢酶，还原后的甲臜是非水溶性的，需要加有机溶剂溶解，因此，MTT法较适宜普通贴壁细胞检测细胞增殖活力。但对本研究的三维悬浮培养体系来说，操作繁琐，重复性差，而且工作量比较大。因此本实验选择CCK8法同时普通贴壁和三维培养这两种不同培养体系中牙髓细胞增殖能力。

成纤维细胞发生nemosis的特点是形成“球形”细胞聚集体的同时细胞开始逐步坏死。与细胞凋亡相比，nemosis不具有凋亡相关分子(如Fas、Daxx、caspase-3)激活和DNA断裂，并且细胞发生nemosis能促使多种促炎因子的生成，因此，nemosis有别于经典的细胞凋亡[3,11,12]。本研究以普通贴壁培养牙髓细胞作为对照组，随着培养时间的延长，对照组OD值逐渐增多；由于吸光度值的大小代表细胞数目多少，因此说明普通贴壁培养的牙髓细胞随着培养时间延长细胞数逐渐增多，并从快速增长逐渐进入平台期。以往的研究认为当细胞受到外界物理或化学性的损伤因子，缺氧以及营养不良等作用下会使细胞增殖能力受到影响。本研究观察到在三维培养发生nemosis的牙髓细胞中，随着培养时间的延长，OD值逐渐减少，说明发生nemosis能使得牙髓细胞增殖能力在一定程度上受损。三维培养牙髓细胞形成“球状”细胞聚集体，进而细胞增殖能力在一段时间内受到抑制。这一改变的激发因素不是由于任何外界毒力刺激，仅是由细胞聚集所引起的。牙髓细胞和细胞之间的紧密接触导致细胞代谢活力下调，可能暗示细胞与细胞之间存在接触抑制—一种在普通贴壁培养细胞中的现象[13]。今后进一步对牙髓细胞nemosis损伤机制的研究将有助于揭示这种细胞激活形式在牙髓组织炎性反应中作用。

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Study on proliferation abilities ofinvitrothree-dimensional cultured human dental pulp cells

ZHAI Shafei1#，JIANG Wenkai2，NI Longxing2*

(1DepartmentofStomatology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China；2DepartmentofOperativeDentistryandEndodontics，FourthMilitaryMedicalUniversity；*Correspondingauthor，E-mail:Longxing_Ni@hotmail.com；#Co-correspondingauthor，E-mail:zhaishafei@xiyi.edu.cn)

ObjectiveTo compare the difference of proliferation abilities between normal adherent cultured dental pulp cells and three-dimensional cultured dental pulp cells.MethodsThe formation of nemosis was initiated by seeding 104dental pulp cells in one well of a U-bottomed, 96-well plate coated with agarose. The normal adherent cultured dental pulp cells in flat bottomed 96-well plate were used as control group. At 20 h，40 h，60 h，80 h after cell seeding, the CCK8 reagent was added. The optical density(OD) values were measured at a wavelength of 450 nm.ResultsOD values gradually increased in the adherent cultured dental pulp cells during the cell culture. In the three-dimensional cultured dental pulp cells，OD values showed no significant change from 20 h to 60 h, but decreased significantly at 80 h after cell seeding(P<0.05). Compared with dental pulp cells in the normal adherent culture, the OD values in the three-dimensional cultures were decreased at each time point(P<0.05).ConclusionThe proliferation ability in the three-dimensional cultured dental pulp cells are weaker than that of normal adherent cultured dental pulp cells.

dental pulp cells；three-dimensional culture；proliferation ability；nemosis

国家自然科学基金资助项目(81371139,81170946);陕西省社会发展科技攻关资助项目(2015SF157)；西安医学院博士科研启动基金资助项目(2015DC21)

翟莎菲，女，1983-08生，博士，讲师，E-mail：zhaishafei@xiyi.edu.cn

2015-11-27

R781

A

1007-6611(2016)03-0247-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.012