脉冲磁疗对脑出血大鼠脑内谷氨酸和胰岛素样生长因子-1表达的影响

宋成宪　李　舜　冯枫华　谢泽良　简颖敏.广州医科大学附属第三医院康复科，广东广州　5050；2.南方医科大学南方医院康复科，广东广州　5055

脉冲磁疗对脑出血大鼠脑内谷氨酸和胰岛素样生长因子-1表达的影响

宋成宪1李舜1冯枫华1谢泽良1简颖敏2▲
1.广州医科大学附属第三医院康复科，广东广州510150；2.南方医科大学南方医院康复科，广东广州510515

目的 观察脉冲磁疗对脑出血大鼠脑组织中谷氨酸和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）表达的影响。方法 清洁级雄性SD大鼠36只，随机分成假手术组、模型组和磁疗组，每组又分为3 d组和7 d组，每个亚组各6只大鼠。采用立体定向技术制作脑出血模型。磁疗组于术后2 h开始脉冲磁疗干预，异名磁极对置于头部，磁距10 cm，平均磁场强度0.01 T，频率50 Hz，20 min/次，1次/d。并于脑出血3、7 d时分别对各组大鼠进行神经行为学评定、谷氨酸和IGF-1浓度的测定。结果 磁疗3、7 d组改良神经功能缺失评分（mNSS）均比对应的模型组下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。脑出血后，脑组织中谷氨酸表达增加，经过脉冲磁疗3、7 d后，谷氨酸浓度均明显下降，低于模型组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。正常脑组织内IGF-1有少量表达，脑出血后，其表达增加；经过磁疗3、7 d后，与模型组相比，IGF-1水平均明显升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。结论 脉冲磁疗可以一定程度上促进脑出血大鼠神经功能的恢复，其机制可能与谷氨酸水平的下降和IGF-1的表达增加有关。

脉冲磁疗；脑出血；谷氨酸；胰岛素样生长因子-1

［Abstract］Objective To observe the effects of pulsed magnetic therapy on the expression of glutamate and insulinlike growth factor-l（IGF-1）after cerebral hemorrhage in rats.Methods 36 male adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham group（n=12），model group（n=12）and magnetic therapy group（n=12）.Each group was randomly divided into 3 d and 7 d subgroups，with 6 rats in each subgroup.The cerebral hemorhage model of rats was made using the technology of stereotaxis.The magnetic therapy group was treated with pulsed magnetic therapy（0.01 T，50 Hz，20 min/times，1 times/d）after hemorrhage 2 h.The modified neurological severity score（mNSS），the concentration of glutamate and IGF-1 were evaluated at 3 d and 7 d after cerebral hemorrhage.Results Compared to the model group，the mNSS scores in 3 d and 7 d magnetic therapy group decreased significantly（P＜0.01）.After cerebral hemorrhage，the concentration of glutamate increased；in the magnetic therapy group，the concentration of glutamate was significantly decreased than in the model group after hemorrhage 3 d and 7 d（P＜0.01）.IGF-1 had little expression in the normal brain tissue，after cerebral hemorrhage，its expression increased；the concentration of IGF-1 in the magnetic therapy group was significantly increased than in the model group after hemorrhage 3 d and 7 d（P＜0.01）.Conclusion Pulsed magnetic therapy can promote the recovery of neural function in rats.This effect may be associated with the decline of glutamate and the higher expression of IGF-1.

［Key words］Pulsed magnetic therapy；Cerebral hemorrhage；Glutamate；Insulin like growth factor-l

脑出血后局部组织的水肿和继发性的神经细胞损伤是影响预后的重要因素。一方面，脑组织损伤的同时可以引起兴奋性氨基酸（excitatory amino acid，EAA）水平的升高，适量的EAA对维持神经细胞的兴奋性是必需的，但高浓度的EAA则具有神经毒性。谷氨酸作为EAA的一种，在中枢神经系统中含量最高。另一方面，脑组织损伤后，可引起内源性神经保护机制的启动，其中包括胰岛素样生长因子-1（insulin-likegrowth factor-1，IGF-1）表达的增加。脉冲磁疗是临床常用的物理治疗方法，许多研究都已经证实它可以促进脑损伤后神经功能的恢复，但对于其具体的作用机制，尚不十分清楚。本研究通过脉冲磁疗干预脑出血大鼠，探讨其对谷氨酸和IGF-1表达的影响，期望进一步明确磁疗在脑出血治疗方面的作用机制，为其临床应用提供进一步的理论依据。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组

清洁级SD雄性大鼠36只，体重230～290 g，南方医科大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK（粤）2011-0015，室温、常湿饲养，普通饲料，自由饮水。采用随机数字表法分为假手术组、模型组和磁疗组，每组又分为3 d组和7 d组两个亚组，每个亚组各6只大鼠。

1.2试剂与仪器

磁疗仪为解放军总医院研制的GMC-B型脉冲磁疗仪，脉冲磁场强度0～1.5 T，磁脉冲电流宽度＜10 MS，脉冲频率20～80次/min，电源220 V、50 Hz。谷氨酸分析仪为日立835-50型氨基酸自动分析仪。放射免疫设备为SN-682型放射免疫γ计数器，上海核福光电仪器有限公司生产。IGF-1放射免疫试剂盒由天津九鼎医学生物工程有限公司提供。

1.3方法

1.3.1脑出血模型制作参考既往文献的造模方法进行脑出血模型的制作［1-2］。大鼠称重后用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后将大鼠固定在大鼠脑立体定位仪上，使前囟和后囟处在同一平面。常规备皮消毒，沿头正中切开一长约10 mm的切口，切开骨膜，暴露前囟。定位于前囟前0.5 mm，右侧旁开3 mm，用牙科钻在此处钻一直径约1 mm的小孔。取血前将大鼠尾置于40℃温水中加热5 min，消毒后距末端1 cm处剪断，取未抗凝血50 μL沿所钻小孔进针深约6 mm（此处为大鼠尾状核头部），以20 μL/min的速度缓慢匀速注入血液，注血结束后留针5 min后缓慢退针，缝合切口，以上操作均严格遵循无菌原则。假手术组除不注血外，余步骤同上。术后大鼠回笼饲养，自由饮食饮水。如死亡或未出现偏瘫症状，则被剔除，随机补充剔除标本，保证最终每组纳入的大鼠数量一致。

1.3.2脉冲磁疗干预方法参考既往研究的磁疗处方［3］。磁疗组动物于术后2 h开始用脉冲磁疗仪进行干预。异名磁极对置于大鼠头部，磁距为10 cm。平均磁场强度为0.01 T，频率为50 Hz，20 min/次，1次/d。

1.3.3标本制备各组大鼠分别在脑出血3、7 d时予10%水合氯醛（0.45 mL/100 g）深度麻醉，迅速打开胸腔，眼科剪剪开右心耳，自左心室灌注0.9%生理盐水，快速冲洗体内血液，致流出液清亮为止，再续用4%多聚甲醛250 mL进行灌注固定，然后断头取脑。沿针孔处作冠状切开，有明显血肿且无蛛网膜下腔出血，未破入脑室者为模型制作成功。模型组和治疗组在冰盘上切取以血肿为中心周围脑组织100 mg，假手术组则取相应部位脑组织100 mg，进行匀浆、离心后取上清液置于-20℃冰箱保存待测。

1.4观察指标

1.4.1神经行为学评定于造模成功后3、7 d时进行改良神经功能缺失评分（modified neurological severity score，mNSS）评定。评定项目包括平衡木实验、行走测试、反常运动、感觉测试、反射缺失和提尾反射等，最低为0分，最高分为18分；0分为神经功能正常，得分越高说明神经功能损伤越严重［4］。

1.4.2谷氨酸含量的测定将标本从冰箱取出后，常温解冻后，4℃4800 r/min离心15 min，然后严格按照日立835-50型氨基酸自动分析仪的要求进行谷氨酸浓度的测定。

1.4.3IGF-1含量测定将标本从冰箱取出后，常温解冻。取每个浓度的标准品、质控血清和样本100 μL于相应编号的试管中，每管均加入100 μL的标志物工作液。除T管（总放射性管）、NSB管（非特异性结合管）以外的各管均加入100 μL抗体工作液，充分混匀后置于4℃温育24 h，然后加500 μL分离剂，充分混匀，静置30 min，4℃3600 r/min离心20 min，弃上清液，用γ计数器测定沉淀物每分钟的放射性活性值，并从标准曲线上得出样本的浓度。

1.5统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1神经行为学评定

假手术组术后神经行为学评定基本正常，各时间点mNSS评分均为0分。模型组、磁疗组与假手术组比较均有神经功能损伤；3、7 d时，模型组和磁疗组mNSS评分比较，差异均有高度统计学意义（P＜0.01）；并且，两组7 d时的神经行为学评分均低于各自3 d时的评分，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　各组mNSS评定结果比较（分，）

表1　各组mNSS评定结果比较（分，）

组别　3 d　7 d　t值　P值模型组磁疗组2.847 2.932 0.017 0.015 t值　P值8.67±0.81 6.83±0.75 4.082 0.002 7.33±0.82 5.50±0.82 3.865 0.003

2.2谷氨酸检测结果

正常脑组织内谷氨酸有一定的基础表达，脑出血后，其表达明显增加，模型组与假手术组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；7 d较3 d时谷氨酸水平有所下降，且差异有统计学意义（P＜0.05）。经过脉冲磁场治疗3、7 d后，与模型组相比，谷氨酸浓度均有明显下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；磁疗7 d时谷氨酸浓度低于3 d时，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2　各组谷氨酸水平比较（μmol/g，）

表2　各组谷氨酸水平比较（μmol/g，）

注:与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01

组别　3 d　7 d　t值　P值假手术组模型组磁疗组F值P值4.62±0.21 8.84±0.83*7.41±0.65*#71.555 0.000 4.60±0.27 7.64±0.55*5.51±0.56*#59.919 0.000 0.143 2.952 5.424 0.889 0.014 0.000

2.3IGF-1检测结果

正常脑组织内IGF-1有少量表达。脑出血后，其表达明显增加，模型组与假手术组相比，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；7 d较3 d时有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。经过脉冲磁场治疗3、7 d后，与假手术组和模型组相比，IGF-1水平均有明显升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；虽然磁疗7 d时IGF-1水平有所下降，但与3 d组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3　各组IGF-1放射免疫测定结果比较（ng/mL，）

表3　各组IGF-1放射免疫测定结果比较（ng/mL，）

注:与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01

组别　3 d　7 d　t值　P值假手术组模型组磁疗组F值P值0.85±0.14 2.36±0.18*2.75±0.22*#176.716 0.000 0.87±0.11 2.07±0.27*2.69±0.26*#101.766 0.000 0.275 2.189 0.431 0.789 0.053 0.675

3　讨论

脑出血后血肿周边及远隔部位可出现不同程度的脑血流下降，下降程度与血肿的大小和部位有关，即存在类似于脑梗死后缺血半暗带的病理变化［5］。脑组织的缺血缺氧，可以引起细胞外EAA水平的升高，适量的EAA是神经细胞维持活性所必需的，而高浓度的EAA则具有很强的神经毒性作用。谷氨酸是中枢神经系统中含量最丰富的EAA，平时储存在神经元突触前囊泡中，在突触前膜去极化时释放到突触间隙。脑出血后脑组织中谷氨酸的表达明显增加，且表达的高低同血肿残腔的体积呈正相关［6］。有学者认为，脑组织缺血缺氧后谷氨酸大量释放所造成的一系列级联反应是导致神经细胞死亡的主要原因［7］。脑细胞外不存在谷氨酸代谢酶，谷氨酸的代谢清除主要由位于星形胶质细胞膜上的谷氨酸转运体来完成。但脑出血后，谷氨酸转运体的水平持续下调，谷氨酸的清除能力下降［8］。故如果能探索出某种治疗方法，减少脑出血后谷氨酸的表达，则理论上可以起到减轻神经细胞损伤的作用。

IGF-1是由70个氨基酸组成的单链碱性多肽分子，对哺乳动物神经系统的生长发育具有至关重要的作用，它通过激活IGF-1受体，促进神经细胞的增殖、分化、突触生长及髓鞘形成［9］。IGF-1在成年脑组织中低水平表达，脑损伤后，IGF-1的水平显著升高，对损伤的神经细胞起到保护作用［10］。吴红瑛等［3］研究发现，大鼠脑缺血2 h时，半暗带区域IGF-1阳性细胞数开始升高，并且IGF-1升高的水平与神经功能缺失呈负相关。有研究表明，给予外源性的IGF-1也可以起到类似的神经保护作用［11］。但目前尚没有见到外源性IGF-1用于治疗人颅脑损伤的报道，且外源性IGF-1价格昂贵，能否通过血脑屏障仍不明确。故如能探索出某种干预方法使内源性IGF-1的表达增加，对于脑损伤的治疗，将会有更大的应用价值。

脉冲磁疗作为一种安全、简便的物理因子治疗方法，对于骨质疏松症、骨关节炎、高血压等多种疾病的治疗具有确切的效果［12-14］。近年也有研究表明，低频脉冲磁疗可以促进神经细胞的再生、增殖与分化，对损伤的神经细胞具有保护作用。有人将其用于外周神经及中枢神经损伤的治疗，取得了一定的临床效果，但其确切的机制仍不十分明确［15-16］。

本研究结果显示，脑出血3 d和7 d时，模型组和磁疗组大鼠均存在神经功能损伤，模型组虽然没有磁疗干预，但7 d时的mNSS评分仍低于3 d时，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明脑损伤后具有一定的自我修复功能。磁疗3 d组和7 d组mNSS评分均低于相应的模型组，说明脉冲磁疗可以促进脑出血后神经功能的恢复。两组mNSS评分随时间的变化与谷氨酸下降的趋势一致，而与IGF-1的浓度变化趋势相反。推测神经功能的恢复可能与谷氨酸浓度的下降及IGF-1水平的升高有关。当然，该结果是在特定的实验条件下得出的，可能不同的磁场剂量、治疗时间、检测方法等会得出不同的实验数据和结果，对此需要更深入的论证。

本研究结果显示，脉冲磁疗可以引起脑缺血组织中IGF-1水平的升高，与既往的研究结果一致［3］。此外，有研究表明，损伤局部给予外源性的IGF-1后，可以抑制脑出血后谷氨酸的表达，从而减轻了其对神经细胞的损伤［17］。对于谷氨酸水平的下降，除了IGF-1的作用外，脉冲磁疗是否也可以通过其他途径影响谷氨酸的分泌或者清除？有研究显示，脉冲磁疗可以引起缺血脑组织周围星形胶质细胞的表达增加［18］。而星形胶质细胞是转运谷氨酸的主要细胞，它可以将细胞外液中90%的谷氨酸转运到细胞内，进而将其分解生成谷氨酰胺，从而减轻其对神经细胞的兴奋毒性［19-20］。虽然本次实验没有直接对星形胶质细胞或其特征性标志物进行观察，但本研究结果也间接验证了上述理论的合理性。

综上所述，本研究结果显示，脉冲磁疗可引起脑出血后血肿局部的谷氨酸水平下降，IGF-1的表达增加，一定程度上促进了脑出血大鼠神经功能的恢复。当然本实验也有许多不足之处，没有进行连续的多个时间点的观察，无法具体明确谷氨酸和IGF-1的动态变化趋势；此外，对于脉冲磁疗引起谷氨酸和IGF-1变化的具体作用机制，有待更深入的研究。

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Effects of pulse magnetic therapy on expression of glutamate and insulinlike growth factor-1 after cerebral hemorrhage in rats

SONG Chengxian1LI Shun1FENG Fenghua1XIE Zeliang1JIAN Yingmin2▲
1.Department of Rehabilitation Medicine，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong Province，Guangzhou510150，China；2.Department of Rehabilitation Medicine，Nanfang Hospital of Southern Medical University，Guangdong Province，Guangzhou510515，China

R743

A

1673-7210（2016）08（a）-0020-04

2016-05-03本文编辑:程铭）

广州医科大学附属第三医院青年基金项目（2012Y10）。

宋成宪（1982.10-），男，南方医科大学2013级创伤骨科专业在读博士研究生；研究方向:神经系统、运动系统疾病康复。