酮咯酸氨丁三醇和罗哌卡因合用对小鼠创口愈合的影响

李鑫焱程桥凡浙录张恒海张倩

酮咯酸氨丁三醇和罗哌卡因合用对小鼠创口愈合的影响

李鑫焱①程桥②凡浙录②张恒海②张倩②

目的：研究酮咯酸氨丁三醇和罗哌卡因对创面粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的表达和伤口愈合的影响。方法：选取清洁级雄性成年昆明小鼠128只，随机分为四组，D组小鼠腹腔注射等剂量的氯化钠溶液0.1 mL/（kg·12 h）；L组于伤口周围浸润注射0.5%的罗哌卡因1 mL/（kg·12 h）；N组腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射液5 mg/（kg·12 h）；H组腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射5 mg/（kg·12 h）复合创口周围浸润注射0.5%的罗哌卡因1 mL/（kg·12 h）。在小鼠手术切口模型完成后的第3、7、10天，每次不放回地从每组中随机抽取8只小鼠随后用Elisa法测定剪取组织中的GM-CSF浓度，并观测每组剩余8只小鼠的切口愈合时间和情况。结果：H组小鼠在第7、10天时伤口GM-CSF 表达较D组高（P<0.05）；在愈合时间上，H组较D组的愈合时间短（P<0.05）；在愈合后瘢痕面积来看，H组的瘢痕面积较L组小（P<0.05），与D组比较差异也有统计学意义（P<0.05）。结论：酮咯酸氨丁三醇和罗哌卡因合用可促进小鼠创面粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达，加快伤口的愈合，且不会引起瘢痕的过度增生。

酮咯酸氨丁三醇； 罗哌卡因； 伤口愈合

First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

随着外科发展以及各种镇痛药物的发展更新，术后镇痛已经成为了临床麻醉镇痛的一个受到广泛关注的问题。随着现代疼痛学的发展和各种镇痛药物的不断更新换代，术后镇痛也由单模式单种药物镇痛逐渐发展为多模式、多种药物复合应用镇痛。药物复合应用可以减小单个药物的用量，同时可以达到良好的镇痛效果。其中，伤口周围浸润局麻药作为一种操作简便、价格低廉且不良反应少的术后镇痛方式，在临床上有着广泛的应用。罗哌卡因是一种长效的酰胺类局麻药物，曾有学者在气管插管全麻开颅手术联合应用罗哌卡因阻滞头皮神经，结果显示联合应用罗哌卡因组血流动力学较单纯全麻组稳定，镇痛效果良好[1]。非甾体类抗炎药通过抑制环氧合酶（COX）的活性抑制前列腺素的生成，在术后镇痛中发挥着重要的作用。有刘付丽[2]的研究显示，在腹腔镜胆囊切除术后腹腔内注射罗哌卡因并静脉注射帕瑞昔布钠具有良好的镇痛效果，减少术后吗啡用量。第一代非甾体类抗炎药物——酮咯酸氨丁三醇，是第一个可供注射的非甾体类镇痛药物。有实验支持酮咯酸氨丁三醇用于烧伤患者的术后镇痛效果较好，不良反应少这一结论[3]。而这些药物在临床上应用于术后镇痛时虽然可以达到镇痛的效果，但其对手术切口的愈合是否有影响还尚待研究。GM-CSF即粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，多位学者研究发现其有促进创面愈合的作用，有临床观察研究显示，应用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子可以促进深Ⅱ度烧伤创面的愈合，并防止感染[4]。目前有研究发现，0.5%罗哌卡因用于伤口局部浸润可以促进GM-CSF的表达，有促进伤口愈合的作用[5]。本课题主要研究的是罗哌卡因和酮咯酸氨丁三醇合用对创口周围的GM-CSF的表达及创面的愈合是否有影响。

1　材料与方法

1.1材料 取8周龄清洁的雄性昆明小鼠128只，体重30～40 g（山西省肿瘤医院动物实验中心）。小鼠GM-CSF ELISA试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司）、酮咯酸氨丁三醇注射液、盐酸罗哌卡因注射液。

1.2分组 128只小鼠随机分为四组，每组32只，分别为对照组（D组）、罗哌卡因组（L组）、酮咯酸氨丁三醇组（N组）、酮咯酸氨丁三醇联合罗哌卡因组（H组）。

1.3模型制备 清洁级雄性昆明小鼠128只，0.6%戊巴比妥钠以0.1 mL/10 g行腹腔麻醉，麻妥后固定背部皮肤，用电动剃毛器剃去小鼠颈部以下约3 cm×3 cm大小面积的体毛，以脊柱正中，颈部以下约1 cm处标记约1 cm×1 cm的方形标记。常规消毒，沿标记做全层皮肤缺损。D组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.1 mL/（kg·12 h），L组于创口周围浸润注射0.5%罗哌卡因0.1 mL/（kg·12 h），N组小鼠腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射液5 mg/（kg·12 h），H组小鼠腹腔注射酮咯酸氨丁三醇注射5 mg/（kg·12 h）并且创口周围浸润注射0.5%罗哌卡因1 mL/（kg·12 h），并将各只小鼠单笼饲养。

1.4标本处理 于术后第3、7、10天从各组中随机取8只小鼠处死，后剪取距创口4 mm的包括创面的皮肤组织，所取标本清理后置于-80 ℃冰箱中保存。将所取标本制成匀浆后离心，留取上层清液，用双抗体一步夹心酶联免疫吸附法（Elisa法）测定剪取的皮肤组织中GM-CSF的浓度，为了减少剪取组织的误差，笔者同时选用BCA测定蛋白法测定组织中的总蛋白浓度，计算两者的比值以比较各组标本中GM-CSF的含量。其余小鼠继续饲养至其创面完全愈合，并记录其完全愈合所需要的天数和愈合后的瘢痕面积。

1.5观察指标

1.5.1GM-CSF的表达 小鼠造模成功后第3、7、10天从各组中随机取8只小鼠处死后所取的创面皮肤组织，用Elisa法测定组织中GM-CSF的浓度，并用BCA蛋白法测定组织中总的蛋白浓度，计算出每只小鼠的GM-CSF的浓度/总蛋白浓度的比值，并通过统计学方法进行分析[5]。

1.5.2创面完全愈合所需时间和愈合后瘢痕的面积 将四组剩余的小鼠继续给药直至创面完全愈合并记录创面完全愈合所需要的天数。后将这些小鼠处死，剪取距瘢痕周围1 cm左右的皮肤，在手术显微镜下观察瘢痕的宽度和长度并测量记录[6]。

1.6统计学处理 应用SPSS 17.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（±s）表示，比较采用单因素方差分析法（ANOVA），组间相互比较采用LSD-t检验的方法，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1创面GM-CSF含量 在创面形成后的第3、7、10天，各组创面的GM-CSF占总蛋白的比值逐渐降低，各组之间第3天GM-CSF占总蛋白的百分比比较差异均无统计学意义（P>0.05），第7、10天，各组之间GM-CSF占总蛋白的百分比比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1　小鼠创面GM-CSF/BCA比值（±s） %

表1　小鼠创面GM-CSF/BCA比值（±s） %

组别　第3天　第7天　第10天D组（n=8）　28.013±6.219　20.862±4.885　12.938±7.504※▲N组（n=8）　30.088±8.349　20.900±5.124　11.950±5.039 L组（n=8）　32.925±5.454　31.063±6.688*△　23.938±4.178 H组（n=8）　33.000±7.640　27.575±5.499#　20.213±8.417 F值　0.948　6.590　6.286 P值　0.431　0.002　0.002

2.2创面愈合时间和愈合后瘢痕面积 各组愈合时间、瘢痕面积比较差异均有统计学意义（P<0.001），见表2。

表2　各组小鼠创面愈合时间和愈合后瘢痕面积（±s）

表2　各组小鼠创面愈合时间和愈合后瘢痕面积（±s）

*与L组比较，P<0.001；△与H组比较，P=0.002；#与H组比较，P=0.008；※与D组比较，P=0.014；▲与L组比较，P=0.019

组别　愈合时间（d）　瘢痕面积（mm2）D组（n=8）　18.875±2.167*△　11.526±2.876 N组（n=8）　20.125±2.475　10.149±2.615 L组（n=8）　12.000±2.000#　18.649±2.437 H组（n=8）　15.125±2.100　15.187±3.154※▲F值　22.694　15.111 P值　<0.001　<0.001

3　讨论

创口愈合的过程是机体对外来损伤所做出修复的过程。一般包括以下4个阶段：止血、炎症、增殖与重新塑形阶段。其中，创伤后所引起机体的炎症反应在伤口的愈合中有非常重要的作用。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种多功能造血生长因子，可刺激造血前体细胞增殖、分化、向外周转移，又可诱导多种细胞如巨噬细胞、角质细胞等的分化、增殖、活化，而且对其他细胞如成纤维细胞、胶质细胞及皮肤黏膜细胞等具有刺激生长作用[7]，曾被Kaplan等最早在1992年首次把GM-CSF引入急性皮肤创面治疗，证实创周注射rhGM-CSF证实可促进急性皮肤缺损创面愈合[8]。在体外，他们发现GM-CSF 可刺激角质细胞生长，是诱导朗罕细胞分裂增殖的主要因子。本实验组前期研究证明，于小鼠伤口周围局部浸润0.5%的罗哌卡因，伤口周围组织的GM-CSF的浓度升高，且创面愈合时间缩短，证明创周浸润罗哌卡因可以促进创口的愈合[5]。

酮咯酸氨丁三醇是一种非选择性的环氧合酶（COX）抑制剂，它主要是通过抑制COX的活性发挥止痛的作用。Cepeda等[9]的研究发现术后应用酮咯酸可以明显减少术后吗啡的用量，证明其有强大的镇痛作用。COX包括三种：COX-1、COX-2、COX-3，其中COX-2是前列腺素生物合成的关键酶。谭赵云[10]等有研究表明，COX-2和VEGF的表达存在一定的正相关性，并且在增生性瘢痕中存在高表达的现象。

由本实验中可以看出，在造模后第7、10天，与对照组比较，罗哌卡因组的创口GM-CSF的表达明显升高（P<0.05），证明创面周围浸润罗哌卡因可促进切口周围GM-CSF分泌，与本实验组前期得出罗哌卡因用于伤口局部浸润可以促进GM-CSF的表达这一结果吻合[5]。在造模后的第10天，酮咯酸氨丁三醇组GM-CSF分泌较对照组低（P<0.05），推测可能是酮咯酸氨丁三醇抑制了GM-CSF的表达，但尚未有文献报道。第7、10天，酮咯酸氨丁三醇和罗哌卡因合用组与对照组比较，小鼠切口周围GM-CSF的表达上升（P<0.05），但合用组GM-CSF的表达低于罗哌卡因组（P<0.05），推测可能是罗哌卡因促进了创面周围的GM-CSF的分泌。有实验研究显示，COX-2在抑制树突状细胞的分化成熟方面有重要作用，并且GM-CSF可刺激树突状细胞的分化[11]，但并未有证据显示COX-2与GM-CSF之间存在关联性。说明两种药物合用可以促进创口周围GM-CSF分泌，但促进作用不如单纯局部浸润罗哌卡因明显。

在愈合时间方面看，罗哌卡因组愈合所用时间较对照组短（P<0.05），也证实了罗哌卡因促进伤口愈合这一结论[5]。而与对照组比较，两种药物合用创口愈合所用时间缩短（P<0.05），说明两种药物合用可以加速创面的愈合，缩短愈合时间。从瘢痕的面积比较来看，罗哌卡因组的瘢痕面积大于对照组（P<0.05），可能与GM-CSF可以直接和间接促进成纤维细胞增殖和分泌胶原，且促进巨噬细胞分泌血管内皮细胞生长因子（VEGF-6）、转化生长因子-β （TGF-β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子有关[12]，其中VEGF可以直接促进血管新生，可促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性[13]。而这些细胞因子被证明与病理性瘢痕的形成、增生有关，但具体机制尚不清楚[14]。其中，而酮咯酸氨丁三醇组的瘢痕面积较对照组小（P<0.05），推测可能是酮咯酸氨丁三醇抑制了瘢痕增生。罗嘉伦等[15]采用小鼠体内实验研究表明，在50 μmol/L的尼美舒利的作用下，小鼠创口愈合时间与对照组相比无明显差异，而创面则可以达到最佳修复效果，证明COX-2在病理性瘢痕的发生、发展过程中起到了重要的调控作用。而本实验中酮咯酸氨丁三醇为非选择性的COX抑制剂，也与其研究结果较为吻合。而两种药物合用时瘢痕的面积要小于罗哌卡因组（P<0.05），且瘢痕较为光滑平整，可能和酮咯酸氨丁三醇抑制病理性瘢痕的作用有关。实验结果显示两种药物合用时可促进创面GM-CSF的分泌，缩短小鼠创口愈合时间，而酮咯酸氨丁三醇又可通过抑制COX-2的活性来抑制瘢痕过度增生，促进创面的修复，但两种药物合用促进伤口愈合的机制、是否有药物相互的作用尚不十分清楚。另外，两种药物合用时各种药物的最适浓度、合用的时机、同时又能达到良好的镇痛效果等等问题仍是以后的实验中需要研究的方向。

[1]谢柳昭，李刚.罗哌卡因用于头皮神经阻滞效果的护理对策[J].中外医学研究，2013，11（13）：74-75.

[2]刘付丽，唐红丽，董晓西，等.帕瑞昔布联合腹腔内罗哌卡因用于腹腔镜胆囊切除术后镇痛[J].肝胆胰外科杂志，2011，23（1）：21-23.

[3]李荣，张中军.酮咯酸氨丁三醇用于烧伤患者术后镇痛效果观察[J].山东医药，2010，50（34）：108-109.

[4]杨尚凯.深Ⅱ度烧伤创面治疗与愈合后的关系[J].中外医学研究，2014，12（5）：132-133.

[5]王文玺，程桥，田首元，等.局麻药物对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子表达及皮肤愈合的影响[J].中国药物与临床，2014，14（6）：756-758.

[6]罗嘉伦.不同浓度尼美舒利对皮肤伤口愈合的干预研究[D].湛江：广州医学院，2010.

[7]徐鲲，杨敏，孙静，等.重组人粒细胞集落刺激因子促进兔手术联合化疗后的切口愈合[J].基础医学与临床，2013，33 （1）：102-105.

[8] Mann A，Breuhahn K，Schirmacher P，et al.Keratinocytederived granulocytemacrophagecolony stimulating factor accelerates wound healing：Stimulation of keratinocyte proliferation，granulation tissue formation， and vascularization[J]. Invest Dermatol，2001，117（6）：1382-1390.

[9] Cepeda M S，Carr D B，Miranda N， et al.Comparison of morphine，ketorolac，and their combination for postoperative pain-results from a large，randomized，double-blind trial[J]. Anesthesiology，2005，103（6）：1225-1232.

[10]谭赵云，赵柏程，钱利，等.COX-2 和VEGF 在增生性瘢痕中的表达及其临床意义[J].中国美容整形外科杂志，2008，19（5）：348-352.

[11]张苜.环氧合酶抑制剂在胃癌上清液中培养的树突状细胞分化成熟和功能的影响[D].重庆：重庆医科大学，2006.

[12]郭敏，崔文慧，黄宏，等.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与创面愈合[J].创伤外科杂志，2011，13（3）：279-282.

[13]王天祥，邹高峰，李超，等.CGF中VEGF、TGF-β1含量测定及其对软组织创伤愈合影响的实验研究[J].中外医学研究，2013，11（10）：140-141.

[14]武元元，张选奋.病理性瘢痕形成中VEGF 表达及调控的研究进展[J].现代生物医学进展，2012，12（26）：5178-5181.

[15]罗嘉伦，涂腊根，潘丽，等.COX-2信号通路及其调控对皮肤伤口愈合的干预研究[J].解剖学研究，2011，33（2）：101-104.

Effects of Ketorolac Tromethamine Combine with Ropivacaine on Wound Healing in Mice

LI Xinyan，CHENG Qiao，FAN Zhe-lu，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（23）：024-027

Objective：To study the effect of ketorolac tromethamine and ropivacaine on the expression of GM-CSF involved in wound healing.Method：The 128 healthy adult male Kunming mice，cleaning grade，were randomly divided into four groups and group D assigned to be injected intraperitoneally Saline with a equal dose 0.1 mL/（kg·12 h）.Group L injected 0.5% Ropivacaine 1 mL/（kg·12 h） around the cut.N group intraperitoneally Ketorolac Tromethamine 5 mg/（kg·12 h）.Group H injected Ropivacaine 1 mL/（kg·12 h）around the cut combineing with intraperitoneally Ketorolac Tromethamine 5 mg/（kg·12 h），respectively，in 12 hours.After the completion of the incision in mice models，we randomly selected eight mice without being putted back from every group at the 3rd，the 7thand the 10thday，then measured the expression of GM-CSF by Elisa. The rest 8 mice in the every group would be continued to feed to heal completely in order to record the time that the wound healing takes and observe the intertion status.Result：The expression of GM-CSF between group H and D were compared，group H was higher at 7th，10thday（P<0.05）.The healing time of group H was shorter than that of group D（P<0.05）.The area of scar in the group H was smaller than group L（P<0.05），compared with group D，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Ropivacaine combining with Ketorolac Tromethamine can increase the expression of GM-CSF and promote the healing of wound without causing the excessive scar hyperplasia.

Ketorolac Tromethamine； Ropivacaine； Wound healing

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.23.007

①山西医科大学 山西 太原 030001

②山西医科大学第一临床医学院

程桥

2015-12-10） （本文编辑：蔡元元）