大豆7S球蛋白与葡聚糖共价键合纳米凝胶的制备与表征

冯纪璐，齐军茹，翁静宜，刘倩茹，曹静，程萌



大豆7S球蛋白与葡聚糖共价键合纳米凝胶的制备与表征

冯纪璐，齐军茹，翁静宜，刘倩茹，曹静，程萌

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640）

基于蛋白质与多糖的Maillard反应与自组装制备一种新型的绿色的具备核壳结构的纳米凝胶。利用干热反应制备大豆7S球蛋白与葡聚糖的共价接枝物（soy β-conglycinin-dextran conjugates，SDC），通过对SDC热处理使其自组装成大豆7S球蛋白-葡聚糖纳米凝胶（soy β-conglycinin-dextran nanogels，SDN），对其形貌、结构及性质进行分析，并利用多糖的空间位阻效应抑制蛋白质宏观过度聚集的理论指导，探讨尺寸均一SDN的形成机制。形貌学与zeta电位分析表明SDN为具备核壳结构的球状粒子，其外壳由亲水性的葡聚糖构成，内核由凝胶化的蛋白构成；表面疏水性分析表明内核蛋白的三级结构发生转变，疏水基团暴露，从而形成多个疏水空腔；稳定性分析表明SDN具有高度的pH稳定性与储存稳定性，对疏水活性物质的输送载体构建具有重要的借鉴意义。

大豆7S球蛋白；葡聚糖；Maillard反应；自组装；核壳结构；纳米凝胶

引 言

近年来，纳米科技成为了最富活力及最具发展潜力的新兴技术，纳米材料由于其独特的表面效应与小尺寸效应等得到了广泛的关注。构建纳米材料的方法分“从上至下”法（top down）和“从下至上”法（bottom up）[1]。自组装作为一种“从下至上”法，是指基本单元自发地从无序状态变成有序聚集体的方法[2-4]。2009年，Schmitt等[5]用1%（质量）β-乳球蛋白在pH 3～7的范围内通过自组装法制备β-乳球蛋白微胶。研究发现，β-乳球蛋白在 pH＜4.8或pH＞5.6的条件下会形成线形可溶性聚集体，而在等电点范围内（pH 4.8～5.6）能形成具有胶体稳定性的球形微胶。2014年，Chen等[6]用大豆蛋白在pH 5.9的条件下于95℃加热制备具有一定稳定性的大豆蛋白纳米凝胶，但该纳米凝胶具有pH敏感性。

大量研究表明，两亲性嵌段共聚物可以自组装形成稳定的具有核壳结构的纳米粒子[7-9]。蛋白与多糖是食品体系中两大类天然大分子材料，通过自发的Maillard反应（糖基化反应）可以使蛋白的-或-氨基与还原糖的羰基发生共价结合，得到具有优越功能特性的蛋白质-多糖共价复合物（protein- polysaccharide conjugates，PPC）[10]。因此，通过Maillard反应制备出两亲性嵌段共聚物并进一步自组装可以得到蛋白质-多糖纳米凝胶（protein-polysaccharide nanogels，PPN）。Wu等[11]利用Maillard反应的产物及其水解产物通过反溶剂法制备球形的纳米粒子，但所用的戊二醛-乙醇交联剂具有一定的毒性，不利于制备环境友好型纳米材料。Li等[12]研究利用Maillard反应和加热凝胶法制备水合直径约为200 nm的溶菌酶-葡聚糖纳米凝胶，并对布洛芬进行负载。研究表明，该纳米凝胶具有较高的稳定性，在一定pH范围内不发生聚集或解离。然而，研究表明，当颗粒的尺寸降至纳米级（100 nm以下）时，有利于改善其在体内的缓释效果，增长其在体内的循环时间[13-14]。

大豆7S球蛋白是大豆中主要的蛋白，具有降低胆固醇、降血脂等改善脂肪代谢的功能[15]。国内外关于大豆7S球蛋白与多糖的共价结合反应已经有了相关的研究报道[15-17]，在此研究基础上进一步发现大豆7S球蛋白通过多糖共价结合后可以很好地进一步组装形成纳米凝胶，利用蛋白多糖复合物自组装构建纳米粒子，是一种安全无毒、绿色环保的加工方式。目前以Maillard 反应制备蛋白质-多糖共价复合物纳米凝胶的研究基本还未涉及。本文研究利用大豆7S球蛋白糖基化反应和加热变性自组装法制备纳米凝胶，通过对纳米凝胶的粒径、形貌、结构等的研究，系统地分析和阐述其自组装的机理，并探讨了纳米凝胶具有高度稳定性的根本原因。

1 实验材料和方法

1.1 材料

低温脱脂豆粕购自山东省高唐蓝山集团总公司；葡聚糖（48×103～90×103）与8-苯胺基-1-萘磺酸 （ANS）购自美国Sigma公司；其他生化试剂均为分析纯。实验用水为去离子水，电阻为15 MΩ。

1.2 实验仪器

高速冷冻离心机，Himac CR 22G型，日本Hitachi公司；冷冻干燥机，Alpha-4型，德国Christ公司；激光动态粒度扫描仪，Nano-ZS型，英国Malvern公司；荧光分光光度计，F-7000型，日本Hitachi公司；透射电镜（TEM），JEOL-100CXⅡ型，日本电子株式会社。

1.3 大豆7S球蛋白的制备

大豆7S球蛋白根据Nagano法[15]从低温脱脂豆粕中分离而得。大豆7S球蛋白的蛋白含量由凯氏定氮法（N5.71）测量，蛋白含量为84.03%±0.82%。

1.4 大豆7S球蛋白-葡聚糖共价复合物（soy β- conglycinin-dextran conjugates，SDC）的制备

依据相关文献及课题组的经验[15,18]，利用Maillard反应制备SDC，使大豆7S球蛋白的-或-氨基与葡聚糖末端的还原羟基发生共价结合，并使反应控制在Maillard反应起始阶段，得Amadori重排产物。分别取质量比为1:1的大豆7S球蛋白和葡聚糖混合，将混合物溶解于去离子水中使其浓度各达100 g·L-1，充分搅拌4 h，调pH至7.0，并进行冷冻干燥。干燥后的粉末过筛孔尺寸为0.125 mm的筛网，然后放置在底部装有饱和KBr溶液的干燥器中（保持其相对湿度为79%），于60℃中反应4 d。所得产物按质量体积比1:10的比例加入去离子水，搅拌一定时间使其充分溶解。10000离心15 min后，上清液进行冷冻干燥，所得粉末即为SDC，置于干燥器中保存备用。

1.5 大豆7S球蛋白-葡聚糖纳米凝胶（soy β- conglycinin-dextran nanogles，SDN）的制备

取一定量的SDC粉末溶解于一定量的去离子水中配成浓度为1 mg·ml-1的均一溶液，用0.1 mol·L-1的HCl溶液调节pH至4.8，然后放置在95℃的水浴中孵育50 min，冷却后即为SDN。

1.6 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

SDS-PAGE根据Laemmli法[19]实施，对SDC的形成进行分析。分离胶与浓缩胶的浓度分别为12%与5%。称取一定量的样品加入样品缓冲溶液[0.125 mol·L-1Tris-HCl 缓冲液，其中十二烷基硫酸钠（SDS）含量为10 g·L-1、2-巯基乙醇（2-ME）含量为20 ml·L-1、甘油含量为50 ml·L-1、溴酚蓝含量为0.25 g·L-1]，使样品中蛋白质的含量为5 mg·ml-1。电极缓冲液为pH约为8.3的含有SDS的Tris-甘氨酸缓冲液。上样前将样品在沸水里加热5 min，电泳的上样量为10 μl。凝胶电泳于恒定电流下进行，样品于浓缩胶时电流为40 mA，进入分离胶后将电流调为80 mA，当染料前沿距橡胶框底边1 cm时停止电泳。电泳完成后，一片凝胶采用考马斯亮蓝R250染色45 min，染色后于脱色液中脱色至无底色，完成后胶片拍照分析；另一片凝胶用Schiff试剂在暗处染色16 h，再用5%醋酸脱色至红色条带显现，拍照分析。

1.7 动态光散射（DLS）

样品的表观流体力学直径（h）和多分散系数(PDI)采用Zetasizer Nano-ZS仪器进行测量。样品测量前不经过滤，在25℃下测量3次取平均值。

样品的zeta电位同样采用Zetasizer Nano-ZS仪器测量，激光器为4 mV的He-Ne激光器，入射波长为633 nm，于25℃下测量3次取平均值。

1.8 透射电子显微镜（TEM）

SDN的透射电镜测试是在加速电压为80 kV的JEM-2100F透射电镜上进行的。用过膜的双蒸水稀释样液至3 μg·μl-1，取5 μl滴至碳支持膜上，多余的样液用滤纸吸去，再滴加10 μl 10 g·L-1的磷钨酸进行负染色5 min，用滤纸吸去多余液体，在室温下干燥12 h。

1.9 蛋白表面疏水性（0）的测定

蛋白样品的表面疏水性（0）测定是利用8-苯胺基-1-萘磺酸 (ANS)作为荧光探针根据Haskard等[20]的方法修改进行的。将一定量的样品用0.01 mol·L-1pH 4.8～12的标准缓冲液稀释至一定浓度梯度（0.02～0.2 mg·ml-1）。取4 ml样液与20 μl ANS溶液（8×10-3mol·L-1）混合均匀，测试前在暗处静置3 min。采用F7000荧光分光光度计测量样液的荧光强度，激发波长为390 nm，发射波长为470 nm。各浓度下实际荧光强度为样液荧光强度减去空白液（即不添加ANS溶液的样品）荧光强度，以样品浓度为横坐标，实际荧光强度为纵坐标，用最小二乘法进行拟合，所得直线的斜率即为蛋白样品的表面疏水性。

2 实验结果与讨论

2.1 SDC的形成与鉴定

糖基化产物的形成常用SDS-PAGE图谱进行鉴定，浓缩胶与分离胶交界处谱带的出现表明了高分子量物质的生成[21]。SDC的SDS-PAGE图谱如图1所示，图1(a)为蛋白染色图谱，图1(b)为糖染色图谱。图1(a)条带1可以清晰地观察到大豆7S球蛋白的3条特征谱带——ʹ,和亚基谱带，与张曦[15]的研究结果一致，表明所提取的大豆7S球蛋白纯度较高；条带2中大豆7S球蛋白的特征谱带颜色变浅，且分离胶顶部出现颜色较深的谱带，说明高分子量的物质得以形成。图1(b)条带1有谱带出现，因为大豆7S球蛋白为糖蛋白；条带2中高分子量谱带有明显的显色。因为中性的葡聚糖不能在糖染色电泳中往下移动，且大部分非共价相互作用在凝胶电泳中遭到破坏，因此糖基化产物蛋白染色和糖染色图谱中浓缩胶与分离胶分界处的多分散性高分子量谱带的出现证明了大豆7S球蛋白与葡聚糖发生了共价接枝，形成了共价复合物。

图1 蛋白质染色和糖染色的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱

2.2 SDN的制备

大豆7S球蛋白的等电点为4.8[22]，系统地研究了一定大豆7S球蛋白浓度（0.1～10 mg·ml-1）的SDC在pH 3.8～5.8范围内于一定温度（75～95℃）的水浴中孵育5～60 min所制备的SDN的表观流体力学直径（h）及多分散性系数（PDI）。研究发现蛋白浓度为1 mg·ml-1、pH为4.8、加热温度为 95℃、加热时间为15～60 min的条件下均可制备出粒径分布较窄的h为88～103 nm的纳米凝胶。后续研究中选用加热时间为50 min作为自组装条件，该条件下制备出纳米凝胶的粒径分布如图2所示。

图2 大豆7S球蛋白-葡聚糖纳米凝胶的粒径分布

2.3 SDN的形貌与结构

2.3.1 SDN的形貌学分析

TEM图像（图3）显示纳米凝胶为具有核壳结构的球形粒子，显色较浅的为亲水性葡聚糖外壳，显色较深的为疏水性大豆7S球蛋白内核。由于葡聚糖外壳的结构较为疏松而蛋白内核的结构较为紧密，因此在TEM制样过程中葡聚糖容易发生脱水聚集而使外壳相互交联[11]。此外，从TEM观察到SDN粒子的粒径（约为45 nm）较DLS测量的粒径（83.33 nm±0.03 nm）小，推测是由于所制备的纳米凝胶具有一般凝胶的溶胀作用，DLS测试是在水溶液状态下，而TEM测试时样品处于干燥状态，纳米凝胶在两种状态下分别溶胀和收缩，具有一定的溶胀比。

图3 大豆7S球蛋白-葡聚糖纳米凝胶的透射电镜图

2.3.2 SDN的表面疏水性（0）分析

8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）可与蛋白质表面的疏水基团相互作用产生荧光光谱，采用ANS荧光探针法测定蛋白样品的表面疏水性（0）可以反映蛋白空间构象的转变[20]。图4(a)为不同物质在pH 7.0条件下的表面疏水性，其中，“heated β-conglycinin”为大豆7S球蛋白于60℃的干热条件下加热4 d的样品，“mixture”为大豆7S球蛋白与葡聚糖的混合物。可见，heated β-conglycinin的0与天然的大豆7S球蛋白没有本质差别，表明干热条件下蛋白的自聚集对蛋白的表面疏水性没有影响。混合物的0与大豆7S球蛋白的0相比略有下降但无本质区别，表明游离的葡聚糖对蛋白表面疏水性没有影响。共价复合物中蛋白的表面疏水性与大豆7S球蛋白没有本质性差异，因为糖基化产物的表面疏水性取决于两个方面：一方面，蛋白在干热反应条件下发生部分变性，分子内部的疏水基团部分暴露于蛋白表面，使蛋白的0增加；另一方面，亲水性的葡聚糖共价结合于蛋白表面，使糖基化产物的0下降。而SDN的表面疏水性与大豆7S球蛋白和糖基化产物相比显著增加，这是由于在自组装过程中蛋白受热变性，疏水基团进一步暴露，导致0显著增加，即蛋白的空间结构发生转变。

图4 不同样品的表面疏水性指数[a～g表示显著性差异（p＜0.05）]

SDC与SDN在不同pH条件下的的表面疏水性如图4(b)所示。在所研究的pH范围内，SDN的0与SDC相比都显著增加，再次表明SDN中大豆7S球蛋白的疏水基团暴露，其三级结构发生转变。此外，两者的表面疏水性差异在酸性条件下特别是在蛋白等电点附近尤其明显。这是由于蛋白的结构在是由两种作用力所决定的：吸引作用（主要为疏水聚集作用）和排斥作用（主要为静电排斥作用），两者的自由能基本相同[10,23]。因此，当蛋白所处的环境发生微小的变化（如pH的改变）就会使蛋白的结构发生转变，从而导致其表面疏水性发生显著的改变。SDN在pH条件下0的变化情况有利于其对疏水性生物活性物质的装载与释放。

2.3.3 SDN的zeta电位分析

图5为天然的大豆7S球蛋白、大豆7S球蛋白/葡聚糖混合物及CDN在不同pH条件下的zeta电位。三者在pH低于蛋白等电点（pH 4.8）时均带正电荷，在高于等电点时均带负电荷，在等电点附近不带电。但与其他二者相比，CDN在pH范围内zeta电位的绝对值均比较低。Zhou等[24]利用茶多酚与葡聚糖-明胶的共价复合物通过复合凝聚过程形成具有核壳结构的茶多酚-明胶-葡聚糖复合凝聚胶束(C3Ms)，研究其zeta电位值发现C3Ms的电位绝对值较低，从而分析C3Ms是以葡聚糖为壳，明胶-茶多酚的复合凝聚为核。类似的，本研究中SDN同样具备核壳结构，以不带电的葡聚糖为壳，以大豆7S球蛋白为核，与上述TEM测试结果一致。

图5 不同样品在pH 2～12范围内的zeta电位

2.4 SDN的组装机理

综合上述讨论结果，推测具备核壳结构的SDN其组装机理如下：亲水性的葡聚糖通过Maillard干热反应接枝到大豆7S球蛋白上，制得具有两亲性的大豆7S球蛋白-葡聚糖嵌段接枝物。经过进一步的热处理，大豆7S球蛋白发生变性并凝胶化，分子内部的疏水基团暴露，在疏水聚集的作用下蛋白有聚集的趋势，但共价接枝到蛋白上的葡聚糖发挥空间位阻效应阻止蛋白聚集并形成纳米凝胶。亲水性的葡聚糖在加热条件下自组装形成外壳，而部分凝胶化的具有一定空间网络结构的大豆7S球蛋白自发形成内核，从而使纳米凝胶具备核壳结构。从表面疏水性分析讨论可得，蛋白的疏水性链段在热变性处理阶段后暴露于分子表面，使纳米凝胶内核形成多个疏水空腔，此结构对于疏水分子具有较高的亲和度，因此可以用于运载疏水性生物活性物质。SDN的模型如图6所示。

图6 大豆7S球蛋白-葡聚糖纳米凝胶的模型

2.5 SDN的稳定性

蛋白质属于聚两性电解质，在等电点附近所带的静电荷为零，在疏水聚集作用的驱动下会产生聚集体。研究表明，未经亲水性修饰的聚两性电解质纳米粒子通常具有pH敏感性[25-26]。通过DLS观察纳米凝胶在pH 2～12条件下的稳定性。图7(a)显示在所研究的pH范围内，纳米凝胶的粒径没有显著变化，PDI值均小于0.2，表明所制备的纳米凝胶具有高度的pH稳定性。推测此种pH稳定性来源于大豆蛋白的凝胶网络结构和葡聚糖的立体效应与亲水性。一方面，当pH远离大豆7S球蛋白的等电点时，内核的蛋白由于静电排斥作用趋于相互远离，但在热处理的过程中所形成的凝胶网络结构使纳米凝胶的粒径保持稳定；另一方面，当pH接近p时，处于不同内核的蛋白在疏水聚集作用下趋向于彼此聚集，但通过Maillard反应共价接枝到蛋白上的葡聚糖由于空间位阻效应与亲水性屏蔽了内核的蛋白，使SDN保持稳定。

图7 大豆7S球蛋白-葡聚糖纳米凝胶的稳定性

图7(b)为SDN在4℃下储存13个月的粒径分布。结果显示，SDN没有发生二次聚集且粒径基本没有改变，表明所制备的纳米凝胶处于热力学平衡状态[27]，在长期储存中能维持稳定。图7(c)为新鲜制备的与冻干复溶的SDN的DLS测试结果。冻干后的SDN粉末无须借助超声等手段便可立即复溶分散于蒸馏水中，具有较好的水合分散性，此外复溶后纳米凝胶的粒径和粒径分布与新鲜制备的纳米凝胶差异不大，表明纳米凝胶溶液可以进行冻干并以粉末的形式进行保存。以上各种优异的特性为纳米凝胶在食品工业中的应用提供了可能性。

3 结 论

本研究通过糖基化反应和自组装方法成功地制备了粒径约90 nm的具备核壳结构的纳米凝胶，并通过透射电镜、激光动态粒度扫描仪和荧光分光光度计等分析手段得到以下结论。

（1）形貌学观察可得纳米凝胶为具有核壳结构的球形粒子，zeta电位证实纳米凝胶以葡聚糖为壳，大豆7S球蛋白为核。

（2）表面疏水性结果表明纳米凝胶内大豆7S球蛋白的三级结构遭到破坏，疏水基团暴露而使纳米凝胶内核形成多个疏水空腔，有利于运载疏水性物质。

（3）所制备的纳米凝胶具有高度稳定性。在pH 2～12范围内没有二次聚集，其粒径基本不变；在4℃下存放13个月粒径变化不大；冻干复溶对纳米凝胶的粒径基本没有影响。具有良好的应用前景。

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Preparation and characterization of soy β-conglycinin-dextran nanogels based on Maillard reaction

FENG Jilu, QI Junru, WENG Jingyi, LIU Qianru, CAO Jing, CHENG Meng

(School of Food Science and Technology, South China University of Technology, Guangzhou 510640, Guangdong, China)

The novel protein-polysaccharide nanogels were fabricated through a combination of Maillard reaction and self-assembly method, which is facile, safe and green. First, amphiphilic soy β-conglycinin-dextran conjugates (SDC) were prepared by grafting dextran onto soy β-conglycininMaillard dry-heating reaction. Then, a heat treatment above the denaturation temperature of protein was used to form soy β-conglycinin-dextran nanogels (SDN). The morphology observation indicated that SDN were of spherical shape with core-shell structures, and the zeta-potential study further verified that soy β-conglycinin was covered with nonionic dextran. The surface hydrophobicity investigation displayed that the conformation of protein was changed and the hydrophobic groups of soy β-conglycinin were exposed to the surface of protein. Therefore, several hydrophobic compartments were formed in the core. The nanogels were pretty stable against long-term storage and pH change. These valuable properties and the low toxicity of nanogels may provide a promising way to deliver hydrophobic compounds.

soy β-conglycinin; dextran; Maillard reaction; self-assembly; core-shell structure; nanogels

supported by the National Natural Science Foundation of China (31370036) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2015Z2119).

date: 2016-01-11.

Prof. QI Junru, jrqi@scut.edu.cn

TS 201.7

A

0438—1157（2016）09—4020—07

10.11949/j.issn.0438-1157.20160046

国家自然科学基金项目（31370036）；中央高校基本科研业务费专项资金（2015Z2119）。

2016-01-11收到初稿，2016-05-06收到修改稿。

联系人：齐军茹。第一作者：冯纪璐（1992—），女，硕士研究生。