添加顺序对β-乳球蛋白与EGCG及葡萄糖三元复合物结构和功能的影响

姚文俊，周 磊，付珊琳，钟俊桢*，刘成梅

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛奶中乳清蛋白的主要成分，约占50%[1]。β-LG在中性pH值下为单体和二聚体共存状态。每个单体由162 个氨基酸残基组成，分子质量约为18.4 kDa[2]。它含有8 个反平行β-折叠和α-螺旋[3]。β-LG是一种优良的天然活性载体[4]，它可以结合多种活性物质，包括亲水性、疏水性和两亲性物质。

食物体系是一个多重复杂的系统。目前，大量研究报道了β-LG和其他活性物质的组合对其结构和功能的影响。最常见的方法有2 种，一种是直接混合以氢键、疏水键为主要作用力形成非共价复合物[5]。Li Min等[6]通过荧光等光学手段研究了牛血清白蛋白与表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）间的非共价结合。姜黄素与β-LG通过疏水相互作用结合后，蛋白质结构发生变化，姜黄素的抗氧化活性得到改善[7]。然而，由疏水键、氢键等形成的非共价复合物易受溶液和环境的影响而发生可逆现象[8-9]。一种是以碱处理、酶催化、自由接枝聚合、美拉德反应等方法共价结合形成共价复合物，例如Wu Xuli等[10]通过自由基法得到β-LG与EGCG和绿原酸（chlorogenic acid，CA）共价复合物，发现β-LGEGCG和β-LG-CA可以降低β-LG的致敏性。蛋白质与其他物质形成共价复合物是当前的研究热点。通过共价处理形成的共价键是不可逆的，且其复合物更稳定[11-12]。特别地，共价形成的复合物较非共价复合物具有更好的结构和功能特性。β-LG与儿茶素通过自由基接枝法得到的共价复合物与非共价复合物对比发现，共价复合物的抗氧化性和对β-胡萝卜素的保留率有所提高[13]。乳清分离蛋白与EGCG通过碱法得到共价复合物后，起泡性和乳化性都得到改善[14]。牛血清白蛋白和葡聚糖的共价复合物可以抑制牛血清白蛋白的聚集，而二级结构不受美拉德反应时间的影响[15]。但是，大量的研究都集中在2 种物质的结合上，例如蛋白质和多酚，蛋白质和多糖以及其他二元复合物，目前关于β-LG与多酚和多糖的三元共价复合物的影响研究较少。

近年来，三元复合物成为研究的热点，三元复合物较二元复合物会展现更多不同的结构功能性质。如Harbertson等[16]发现单糖和双糖可以形成氢键增加单宁与蛋白质之间的作用力，并提高蛋白质单宁复合物的溶解度。多糖还可以竞争抑制蛋白质多酚复合物的聚集[17]。此外，多酚也会对蛋白质和多糖的复合物产生影响。槲皮素可通过静电和疏水相互作用增加阿拉伯胶与β-LG的相互作用[18]。因此，多糖对蛋白质-多酚复合物和多酚对蛋白质-多糖复合物有不同的影响。对于特定的蛋白质多酚多糖，不同的添加顺序将影响复合物之间的结构和功能性质。Yang Wei等[19]以不同的添加顺序获得乳铁蛋白，果胶和EGCG三元非共价复合物。发现EGCG和果胶的添加顺序在最终形成的复合物的结构和功能方面差异很大。然而，目前大多数研究都集中在非共价复合物上。对于不同添加顺序对三元共价结合复合物结构的影响以及与非共价复合物的区别尚不清晰。

因此，本研究采用2 种方法形成不同添加顺序的β-LG、EGCG和葡萄糖（glucose，Glc）共价复合物和非共价复合物。通过荧光光谱和圆二色（circular dichroism，CD）光谱表征其结构变化，并比较它们的起泡性和乳化性质。探讨不同添加顺序对复合物的影响以及共价复合物与非共价复合物的区别，为食品加工顺序对食品体系的影响研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛乳β-LG、EGCG 美国Sigma公司；8-苯胺基-1-萘磺酸钠（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、过硫酸氨（ammonium persulphate，AP）、Glc 北京索莱宝生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FreeZone 12-Plus真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；Ultra-TurraxT25高速分散机 德国IKA公司；UV-1600PC紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；F-7000荧光分光光度计 日本Hitachi公司；Mini-Protean Tetra Cell电泳仪 美国Bio-Rad公司；MOS-450 CD光谱仪 法国Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 共价复合物及非共价复合物的制备

参考Rawel等[20]的方法，采用碱法合成β-LG-EGCG共价复合物。0.25 g β-LG溶解在25 mL去离子水中搅拌过夜，然后用0.1 mol/L NaOH溶液将蛋白质溶液的pH值调节至9.0。称取4 mg EGCG溶解在25 mL去离子水中，使其浓度为0.35 mmol/L，并将pH值调至9.0。蛋白质溶液与EGCG溶液按体积比1∶1混合并连续搅拌24 h（加入质量分数0.02%的叠碳化钠）。然后透析48 h除去多余的多酚。最后，冷冻干燥得到样品。

参考Liu Fuguo等[21]的方法，采用美拉德反应制备β-LG-EGCG-Glc共价复合物，称取β-LG-EGCG共价复合物冻干样品与Glc分别溶解在去离子水中，质量浓度为20 mg/mL，等比例混合后用0.1 mol/L的HCl溶液调节pH值至7.0，冷冻干燥得到冻干样品后放入装有饱和溴化钾溶液的干燥器中（60 ℃，相对湿度79%）反应24 h得到β-LG-EGCG-Glc共价复合物。

按照上述方法，按不同的顺序制备β-LG-Glc-EGCG 共价复合物。非共价复合物的制备除去共价复合物制备过程中的碱法和美拉德反应外，其余步骤与上述方法相同。将β-LG-EGCG-Glc共价复合物命名为β-LGEGCG-Glc con，β-LG-Glc-EGCG共价复合物命名为β-LGGlc-EGCG con；β-LG-EGCG-Glc非共价复合物命名为β-LG-EGCG-Glc mix，β-LG-Glc-EGCG非共价复合物命名为β-LG-Glc-EGCG mix。

1.3.2 SDS-PAGE分析

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）根据Laemmli等[22]的方法并略作改动。使用浓缩胶5%、分离胶12%。首先恒定电压80 V维持15 min后换成恒定电压200 V维持45 min。每个孔的上样量为10 μL。电泳之后，通过考马斯亮蓝R-250对凝胶条带进行染色后再用脱色液脱色。采用低分子质量的蛋白质标准物（10～180 kDa）评估样品的分子质量。

1.3.3 紫外-可见吸收光谱分析

参照文献[23]方法，略作修改。将制备的冻干样品用蒸馏水（pH 7.0）配制成0.25 mg/mL的溶液。测定波长294 nm和420 nm处的吸光度，A294nm和A420nm分别表示美拉德反应中级阶段产物和高级阶段产物颜色深浅度的变化。采用蒸馏水作为空白参照。

1.3.4 内源荧光光谱测定

采用F-7000荧光分光光度计测定样品的荧光变化。用pH 7.0的10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液将样品配制成质量浓度为1 mg/mL。其中激发波长为295 nm，发射波长为300～400 nm，激发和发射狭缝均为2.5 nm，以未加样品的缓冲液作为空白。

1.3.5 表面疏水性测定

参考文献[24]的方法，采用ANS作荧光探针测定表面疏水性。称取样品溶于pH 7.0磷酸盐缓冲溶液中，质量浓度为1 mg/mL。取4 mL样品溶液，加入20 μL ANS溶液，旋涡振荡30 s后避光静置10 min，使用F-7000荧光分光光度计测定，激发波长为390 nm，发射波长为400～600 nm，以荧光强度表示表面疏水性。

1.3.6 远紫外CD光谱分析

用磷酸盐缓冲溶液配制成0.1 mg/mL蛋白样品。采用光路长为0.1 cm的圆形石英比色皿进行远紫外CD光谱分析，扫描范围为185～250 nm。扫描9 次取平均值。

1.3.7 乳化性及乳化稳定性测定

根据文献[25]的方法，取6 mL样品溶液，加入3 mL一级大豆油，使用ULTRA-TURRAX分散机以13 000 r/min均质1 min，从底部吸取50 μL，立刻与5 mL 0.1% SDS混合摇匀。然后于500 nm波长处测吸光度A0。10 min后再次吸取50 μL乳状液与5 mL 0.1% SDS溶液混合均匀，在500 nm波长处测吸光度A10，实验重复3 次取平均值。乳化性及乳化稳定性按公式（1）、（2）计算：

式中：ρ为稀释前的蛋白质质量浓度/（mg/mL）；L为光程（1 cm）；φ为形成乳液的油体积分数（0.25%）；DF为稀释倍数（100）。

1.3.8 起泡性及泡沫稳定性测定

参考文献[26]的方法，取10 mL样品于精密刻度管中，记录最初体积V0，然后使用ULTRA-TURRAX分散机以13 000 r/min均质1 min，记录体积V1，静置30 min后记录体积V2。实验重复3 次取平均值。起泡性及泡沫稳定性按公式（3）、（4）计算：

1.4 数据统计分析

实验结果重复3 次，采用Origin 8.0软件绘图，数据采用IBM SPSS Statistics 24软件进行单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE分析

图1 不同添加顺序形成的共价复合物和非共价复合物SDS-PAGE图谱Fig. 1 SDS-PAGE profiles of covalent and non-covalent complexes formed by different addition sequences

SDS-PAGE主要用于表征β-LG与EGCG和Glc的共价结合过程。如图1所示，天然β-LG分子质量在18 kDa和36 kDa左右，这是因为在中性pH值条件下β-LG的单体与二聚体共同存在。2 种不同添加顺序的共价复合物的条带都迁移较慢，复合物的分子质量变大，表明EGCG、Glc与蛋白共价结合。此外，2 种共价复合物还出现了不同分子质量的条带，表明β-LG与EGCG、Glc之间还发生了蛋白质交联。Kroll等[27]研究发现，EGCG在碱性条件下氧化成醌后，会更容易与蛋白质侧链的赖氨酸、色氨酸等亲核基团发生结合，同时作为一个亲电子中间体更容易与蛋白质形成交联聚合物。而非共价结合β-LG-Glc-EGCG mix、β-LG-EGCG-Glc mix的2 种复合物与天然β-LG的条带相似，没有发生明显的条带迁移。主要是由于SDS-PAGE中，SDS和β-巯基乙醇容易破坏蛋白质与多酚及糖之间的非共价作用健，而破坏不了共价作用键。

2.2 紫外-可见吸收光谱分析结果

美拉德反应的程度可以通过反应产物的颜色深浅反映，在波长294 nm和420 nm处的紫外-可见吸光度可以表示美拉德反应产物的进程。A294nm表示无色中间产物，A420nm表示末期褐变化合物[23]。由图2可知，形成共价复合物后，A294nm和A420nm都明显上升，这表明共价复合物产生了美拉德中间化合物，其中β-LG-Glc-EGCG con复合物在波长294 nm和波长420 nm处的吸光度都较β-LG-EGCG-Glc con复合物高。蛋白质与多糖发生美拉德反应时，蛋白质的氨基与Glc的羰基结合[28]。而多酚也会与蛋白质中的氨基酸残基结合[29]。蛋白质与Glc先反应可以使更多的氨基与Glc的羰基结合，美拉德反应产物也更高。这也表明不同的添加顺序形成的共价复合物产生的美拉德反应进程不同。对于不同添加顺序形成的非共价复合物的吸光度与对照组间并没有明显的差异（P＞0.05），表明不同添加顺序形成的2 种非共价复合物未发生美拉德反应，与SDS-PAGE结果一致。

图2 294 nm和420 nm波长处β-LG及其共价复合物和非共价复合物紫外-可见吸收光谱图Fig. 2 UV-Vis absorption spectra at 294 nm and 420 nm

2.3 内源荧光析

图3 β-LG及其共价复合物和非共价复合物内源荧光光谱图Fig. 3 Intrinsic fluorescence spectra

β-LG中含有色氨酸和酪氨酸残基，属于内源性荧光物质。通过内源荧光光谱可以分析β-LG的构象变化。本实验采用激发波长295 nm，酪氨酸及苯丙氨酸不被激发，可以认为内源荧光来自色氨酸残基[30]。由图3可知，2 种不同添加顺序的非共价三元复合物的荧光强度降低，但β-LG-EGCG-Glc mix（1 538 nm）和β-LG-Glc-EGCG mix（1 481 nm）两者相差不大，且没有出现明显的红移现象。而共价三元复合物较非共价复合物有更显著的荧光猝灭，荧光强度降低显著。β-LG-EGCG-Glc con和β-LG-Glc-EGCG con的荧光强度分别为545.9 nm和271.3 nm。这可能是共价复合物一方面形成了紧密的结构掩盖了色氨酸残基[31-32]，另一方面可能色氨酸参与了共价反应。刘夫国[33]在研究乳铁蛋白与3 种多酚共价结合发现乳铁蛋白的游离色氨酸含量减少，参与了共价反应。此外，β-LG-Glc-EGCG con有明显的红移现象（8 nm），而β-LG-EGCG -Glc con没有明显的红移，说明不同添加顺序形成的共价复合物会使蛋白产生不同的构象变化。Liu Fuguo等[21]研究绿原酸与乳铁蛋白和Glc共价复合物发现，共价复合物比非共价复合物具有更低的荧光强度。本实验结果与Liu Fuguo等[21]的研究结果一致。

2.4 表面疏水性结果

图4 β-LG及其共价复合物和非共价复合物表面疏水性图Fig. 4 Surface hydrophobicity spectra

蛋白质表面疏水性的变化可以通过ANS法检测[34]。有研究报道，ANS与β-LG有2 个结合位点，一个作用在外部β-桶与α-螺旋间的疏水表面，一个作用在β-桶的内部疏水区域[35-36]。由图4可知，非共价复合物和共价复合物的荧光强度都增加，但不同添加顺序的非共价复合物荧光强度没有差异（561.3、577.5 nm）。而共价复合物相差显著（1 024、4 616 nm），表明不同的添加顺序形成的共价复合物在表面疏水性上有很大差异。共价复合物均出现明显蓝移（49、51 nm），表明蛋白质的疏水基团结构暴露。可能的原因是EGCG和Glc与蛋白质的亲水基团共价结合导致蛋白质内部结构改变，疏水基团被暴露。

2.5 CD光谱分析结果

远紫外CD光谱范围为178～250 nm，可以反映蛋白质等生物大分子主链的构象信息。包括α-螺旋、β-折叠以及无规卷曲等信息[30]。β-乳球蛋白包含3 个转角的α-螺旋、9 个β-折叠股[37]，210～220 nm之间有负峰为β-折叠。从图5可以看出，不同添加顺序形成的共价复合物的二级结构发生不同程度的改变。β-LG-EGCG-Glc con与β-LGGlc-EGCG con的β-折叠峰都发生了蓝移，表明β-LG的β-折叠含量发生了改变。通过DichroWeb程序计算得到各复合物二级相对含量见表1。与对照蛋白相比，β-LG-EGCGGlc con的负椭圆率增大（β-折叠增至36.4%），而β-LGGlc-EGCG con的负椭圆率降低（β-折叠减少至32%）。同时由表1可知，这2 种共价复合物无规卷曲分别增加到34.6%和35.0%。Liu Fuguo等[21]发现乳铁蛋白与绿原酸共价结合后再与葡聚糖共价结合，蛋白质的α-螺旋减少，并且无序结构增加。本实验中β-LG-EGCG-Glc con的二级含量变化趋势与Liu Fuguo等[21]研究结果一致。不同顺序形成的非共价复合物的结构呈现相同的变化趋势，β-LG-EGCG-Glc mix和β-LG-Glc-EGCG mix的β-折叠相对含量都增加，分别为36.2%和38.9%，无规卷曲相对含量则减少为27.8%和27.7%。

图5 β-LG及其共价复合物和非共价复合物CD光谱分析Fig. 5 Circular dichroism (CD) spectra

表1 不同复合物的二级结构相对含量Table 1 Contents of secondary structures of different complexes%

2.6 三元复合物的功能性质测定结果

2.6.1 起泡性及起泡稳定性

表2 不同复合物的功能性质Table 2 Functional properties of different complexes

蛋白质的扩散能力、吸水及在空气-水相界面展开重排的能力可以由起泡性能力表征[26]。由表2可知，共价复合物的起泡性比β-LG的起泡性大大提高，其中不同添加顺序得到的共价复合物的起泡性差距明显（P＜0.05），β-LG-Glc-EGCG con的起泡性为121.87%，远高于β-LG-EGCG-Glc con（82.33%），不同添加顺序对其共价复合物结构的影响与其功能性质的变化有关。而直接混合得到的不同添加顺序的非共价复合物的起泡性虽较β-LG提高了10%左右，但非共价复合物两者间的起泡性无明显差别，荧光光谱和CD光谱结果表明不同添加顺序得到的共价复合物结构相差较大，而非共价复合物相差较小，起泡性的实验结果与之一致。此外，从起泡稳定性的研究结果可知，β-LG-Glc-EGCG con的起泡稳定性（64.57%）高于β-LG-EGCG-Glc con（54.20%），同时都远高于β-LG，而非共价复合物β-LGEGCG-Glc mix、β-LG-Glc-EGCG mix的起泡稳定性分别为42.83%和48.73%。由此可知，EGCG和Glc及β-LG的复合物可以提高β-LG的起泡性及起泡稳定性，其中，β-LGGlc-EGCG con复合物起泡性及起泡稳定性效果最好，可能是因为β-LG-Glc-EGCG con复合物分子间的作用力较强，同时在溶液中的黏度最大，因此出现较好的稳定性[32]。

2.6.2 乳化性及乳化稳定性

乳化性的大小可以用作考量蛋白质协助稳定乳液能力的指标，而乳液维持其结构的能力可以用乳化稳定性来衡量[25]。如表2所示，复合物的乳化性均较β-LG有提高，其中，非共价处理得到的β-LG-EGCG-Glc mix、β-LG-Glc-EGCG mix乳化性分别为41.39%和41.86%，较高于共价处理得到的β-LG-EGCG-Glc con （32.45%）、β-LG-Glc-EGCG con（35.62%）。但从乳化稳定性结果可知，共价复合物的乳化稳定性高于非共价复合物。研究表明，蛋白质的乳化性不仅与表面疏水性有关，还与蛋白质的溶解度及粒径有关[24,38]。陈豪等[39]研究发现不同提取方法也会对乳化性有不同的影响。

3 结 论

本研究通过2 种方法制备了β-LG、EGCG、Glc的三元复合物，并讨论了不同的添加顺序对复合物结构功能的影响以及共价与非共价复合物的区别。研究结果表明，不同添加顺序对共价三元复合物影响较大，而对非共价复合物影响不明显。4 种三元复合物的结构发生了不同程度的改变，共价复合物较于非共价复合物有更大的结构改变。其中，添加顺序对共价复合物的结构影响较大，β-LG-Glc-EGCG con比β-LG-EGCG-Glc con有更低的荧光猝灭以及更高的疏水性。而对于非共价复合物，不同的添加顺序对其影响不明显。乳化性和起泡性功能性质结果表明共价复合物的功能性质优于非共价复合物，共价复合物中β-LG-Glc-EGCG con的功能性质均优于β-LG-EGCG-Glc con。而不同添加顺序形成的非共价复合物没有明显差别。