克里米亚-刚果出血热病毒可视化逆转录环介导等温扩增快速检测法的建立

韩一芳　钟璟皓　张晨　张琪　吕恒　胡丹　张锦海　王长军

210002 南京军区军事医学研究所 疾病预防控制所



·论著·

克里米亚-刚果出血热病毒可视化逆转录环介导等温扩增快速检测法的建立

韩一芳钟璟皓张晨张琪吕恒胡丹张锦海王长军

210002 南京军区军事医学研究所 疾病预防控制所

目的建立克里米亚刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)的可视化逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)快速检测法。方法体外合成CCHFV的S基因，构建重组质粒，体外转录为模板RNA，在线设计3组LAMP引物，使用实时浊度仪筛选出最佳引物，以羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue，HNB)作为指示剂，建立可视化RT-LAMP反应体系。结果实时浊度检测结果显示合成的3组LAMP引物中第1组引物的扩增效率最高， 峰值出现于20 min。添加环引物后，扩增效率进一步提高，13 min即可达到峰值。利用最佳引物建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法最低检测限浓度为10拷贝/μl，检出时间为30 min，较巢式RT-PCR法和实时定量RT-PCR法分别高1-3个数量级。该方法稳定性好，不会与症状相近的病原体如肾综合征出血热汉坦病毒(汉滩型和汉城型)、马尔堡病毒、新型布尼亚病毒、埃博拉病毒(GP蛋白和VP蛋白)产生交叉反应。结论建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测法，灵敏度好、特异度高、快速廉价、操作简单，无需开盖即可直接观察结果，适用于条件有限的基层单位和偏远地区。但仍需临床样本进行进一步验证。

【主题词】克里米亚-刚果出血热；逆转录环介导等温扩增；可视化检测

Fund programs: National Special Project of Prevention and Treatment of Major Communicable Diseases(2013ZX10004103，2013ZX1004218); Jiangsu Provincial Supporting Technology (social development) Project(BE2013603)；Military Key Project(BWS14J025)

克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorr-hagic fever, CCHF)由克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV)引起，1944年在克里米亚地区首次出现，随后在刚果暴发而得名[1]。目前广泛分布在非洲、亚洲和欧洲东南部的多个国家[2]。该病为自然疫源性疾病，宿主为牛、羊等牲畜，主要通过蜱咬传播至人。主要临床症状为高热、头晕、头痛、呕吐、出血等，病死率超过30%[1,3]。目前尚缺乏有效的CCHF疫苗[4]，而WHO推荐的主要治疗药物利巴韦林在临床应用中存在较大争议，仅在发病早期使用能够取得较好的疗效[5]。我国CCHF疫源地局限于新疆巴楚地区，而该地区医疗和科研水平相对落后。因此，建立一套简单经济、快速有效的CCHFV检测方法能够为患者争取最佳治疗时间，同时对于偏远地区疫情的防控具有重要的意义。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本学者Notomi在2000年发明[6]。该技术操作简便快捷，具有高度的敏感性和特异性，结合显色剂可肉眼判断结果，非常适合疫情现场或条件有限的实验室对病原实现快速诊断。

本课题通过序列分析比对选择出同源性较高的病毒株的S基因(GenBank: KJ682823.1)进行全基因合成，构建重组质粒后体外转录为模板RNA，同时设计RT-LAMP引物，以羟基萘酚蓝(Hydroxyna-phthol blue，HNB)作为指示剂，建立对CCHFV 的可视化快速检测方法。

1　材料与方法

1.1主要仪器试剂Loopamp实时浊度仪(LA-320C，北京蓝谱公司)，实时荧光定量PCR仪(ABI 7500 Fast,美国Applied biosystems公司)，PCR仪(TC-512，英国Techne公司)，微量分光光度计(OD-1000+，One Drop)，线性化质粒载体pGEM-T easy、Riboprobe System-T7体外转录试剂盒(美国Promega公司)，胶回收试剂盒、SanPrep柱式质粒小量抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，RT-LAMP扩增试剂盒(北京蓝谱生物科技有限公司)，羟基萘酚蓝(美国Sigma公司)，限制性内切酶(SpeI)、One Step PrimeScriptTMRT-PCR、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、TaKaRa TaqTM、dNTP mixture、250 bp DNA Ladder Marker(大连宝生物工程有限公司)

1.2标准品质粒的构建在NCBI公共数据库中，以“Crimean-Congo hemorrhagic、complete、S”为关键词搜索CCHFVS基因全长片段共80条，利用MEGA4.0软件进行比对分析，选择同源性较高的S基因片段(GenBank: KJ682823.1；1660 bp)，委托上海生工公司进行基因合成。将合成的S基因全长片段连接至pGEM-T载体，构建重组质粒，酶切鉴定后测序确证。转化扩增小提质粒后，测定其浓度和纯度备用。

1.3重组质粒的线性化及浓度测定为了获得S基因全长序列的转录产物，须将所构建重组质粒线性化。选定S基因上不存在，而在pGEM-T载体上仅有一个的SpeI酶切位点，将重组质粒用SpeI内切酶于37℃消化2 h，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，观察线性化结果，回收纯化，测定浓度及纯度后备用。

1.4体外转录和模板RNA标准品的制备按照Riboprobe System-T7试剂盒说明进行体外转录。室温配制反应体系(20 μl)：5×磷酸盐缓冲液4 μl，二硫苏糖醇(100 mmol/L)2 μl，核酸酶抑制剂(40 U)1 μl，核糖核苷三磷酸(rNTP，终浓度各为0.5 mmol/L)4 μl，T7 RNA聚合酶(18U)1 μl，线性化质粒6 μl，RNase Free water 2 μl，37℃水浴1 h转录反应后，加1.5 μl脱氧核糖核酸酶(RQ 1 RNase Free DNase，1 U/μl)，37℃继续反应20 min以去除DNA模板；然后用RNA纯化试剂盒纯化转录产物，测定体外转录RNA产物的浓度和纯度，计算拷贝数，计算公式为：拷贝数=RNA，浓度(g/μl)×加样体积×阿氏常数/(质粒总长度×1个bp的平均分子量)。

1.5环引物恒温扩增法的建立

1.5.1LAMP引物的筛选:利用LAMP在线引物设计软件Primer Explorer software 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp 4.0.0/index.html)设计基于CCHFVS基因全长片段(GenBank: KJ682823.1)的3套引物，每套引物包括两条外引物(F3、B3)、两条内引物(FIP、BIP)及两条环引物(LF、LB)，由上海生工公司进行合成和纯化。引物序列见表1；反应体系如下：2×反应液(RM)12.5 μl，FIP、BIP各16 μmol/L，F3、B3各2 μmol/L，酶混合液(EM)1 μl，模板5 μl，加超纯水至25 μl；反应条件为63℃ 60 min，80℃ 5 min；每次反应均设阴性对照，以超纯水作为反应模板。通过浊度仪实时观察扩增曲线，选择浊度最高、扩增速率最快的一组引物为最佳引物进行后续反应。

表1　克里米亚刚果出血热病毒RT-LAMP扩增引物

1.5.2快速检测法和常规检测法的比较:由于环引物并非恒温扩增法所必需，为评估反应体系中环引物(LF和LB)存在与否，是否具有增加反应速率的作用，以108拷贝/μl的体外转录RNA作为模板，2管平行扩增，其中1管在上述反应体系中加入环引物(LF、LB各8 μmol/L)，比较添加环引物的快速检测法与不添加环引物的常规法在扩增效率上的差别。

1.5.3灵敏度的测定:将浓度为107拷贝/μl的体外转录RNA用无酶水10倍比梯度稀释至10 拷贝/μl，以梯度稀释液作为模板进行RT-LAMP反应，反应体系为2×反应液(RM)(pH8.8) 12.5 μl，引物混合液(FIP、BIP各16 μmol/L，F3、B3各2 μmol/L，LF、LB各8 μmol/L)2.5 μl，酶混合液(EM)1 μl，模板5 μl，HNB指示剂(终浓度150 μmol/L)，加超纯水至25 μl；反应条件为63℃ 60 min，80℃ 5 min。反应结束后肉眼观察反应管颜色变化，蓝紫色为阴性反应，浅蓝色为阳性反应。为了明确检测最低限，将RNA模板进一步稀释至更低浓度，取10 拷贝/μl、5 拷贝/μl、2 拷贝/μl和1 拷贝/μl 4个浓度梯度的模板按上述反应体系和条件分别进行3次RT-LAMP检测。

1.5.4稳定性测定:选取与CCHF症状相似，在实际疫情过程中需与之鉴别诊断的肾综合征出血热汉坦病毒汉滩型、汉城型、马尔堡病毒、新型布尼亚病毒、埃博拉病毒(GP蛋白和VP蛋白)作为模板检测所建立方法的稳定性，检测体系同上。

1.6实时定量PCR法的检测选用已报道的针对S基因的实时荧光定量逆转录PCR(real-time reverse transcription PCR, qRT-PCR)引物[7]，由上海生工生物工程有限公司合成纯化。以CCHFV体外转录RNA产物的10倍比梯度稀释液作为模板，使用ABI7500 Fast实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应体系为：2×One Step RT-PCR Buffer III 10 μl， TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4 μl，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μl，荧光探针(10 μmol/L)0.8 μl，ROX Dye II 0.4 μl，模板2 μl，加超纯水至20 μl。反应条件：逆转录反应42℃ 5 min、95℃10 s；扩增反应40个循环，95℃ 5 s、60℃ 34 s。

图1　不同LAMP实验条件下的实时扩增曲线Fig.1　Real-time turbidity curves of different condition for LAMP amplification

1.7巢式PCR法的检测选用文献[8]中的巢式PCR引物，将CCHFV体外转录RNA产物的10倍梯度倍比稀释液作为第1轮模板进行一步法RT-PCR扩增，反应体系为：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μl，2×Buffer 12.5 μl，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μl，模板2 μl，加无酶水至25 μl。反应条件：50℃ 30 min、94℃ 2 min；扩增反应30个循环(94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s)；72℃ 10 min延伸。以第1轮扩增产物稀释500倍作为第2轮扩增的模板，反应体系：第2轮上游引物和下游引物(10 μmol/L)各1 μl，10×Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture(10 μmol/L)0.5 μl，TaKaRa Taq酶0.5 μl，模板2 μl，加超纯水至25 μl。反应条件：95℃ 2 min；40个循环(94℃ 1 min、56℃ 30 s、72℃ 45 s)；72℃ 10 min，4℃保存。将PCR产物进行凝胶电泳成像，确定巢式PCR检测的敏感性。

2　结果

2.1LAMP检测方法的确立

2.1.1引物的筛选:使用所设计的3组引物扩增后发现，第1组引物扩增效率较高，约16 min开始扩增，峰值出现于20 min；而第2组和第3组引物均在25 min以后开始扩增，峰值出现在30 min前后(图1A)，故选择第1组引物进行后续实验。比较第1组引物常规扩增及快速扩增的差异，添加环引物后，扩增效率明显提高，开始扩增时间由第16 min提前至10 min，峰值由20 min提前至13 min(图1B)。

2.1.2LAMP灵敏度:将107拷贝/μl 的CCHFV体外转录RNA产物进行10倍比稀释至10 拷贝/μl，以梯度稀释液作为模板扩增。经检测，实时浊度仪显示107拷贝/μl到10 拷贝/μl均有扩增，而以去离子水作为阴性对照的反应孔无扩增(图2A)；同时，HNB指示剂显色结果与实时浊度仪结果一致，阴性对照孔仍为初始未反应的蓝紫色，而107拷贝/μl到10 拷贝/μl反应孔变为阳性的浅蓝色(图2B)。为进一步明确LAMP反应的最低检测限，将10 拷贝/μl、5 拷贝/μl、2 拷贝/μl和1 拷贝/μl浓度的模板分别进行3次重复反应，结果10 拷贝/μl浓度的模板3次反应均为阳性，而其余3个浓度的模板3次反应均为阴性，因此，所建立的CCHFV可视化LAMP检测方法检测限浓度为10 拷贝/μl。

2.1.3LAMP稳定性以所引起疾病症状接近的病原体作为模板，检测所建立方法的稳定性。实时浊度仪显示仅CCHFV反应孔进行了扩增反应，其余反应管均未发生扩增，且HNB指示剂显色结果与实时浊度仪结果一致，仅CCHFV孔变为了阳性浅蓝色，阴性对照孔和其余病原体反应孔均为阴性蓝紫色。所建立的CCHFV可视化LAMP检测方法稳定性良好。

图2　可视化LAMP检测法敏感度的测定Fig.2　Sensitivity test of the visual LAMP assay

注：1　CCHFV； 2　肾综合征出血热汉坦病毒汉滩型； 3　肾综合征出血热汉坦病毒汉城型； 4　马尔堡病毒； 5　新型布尼亚病毒； 6　埃博拉病毒GP蛋白；7　埃博拉病毒VP蛋白图3　可视化LAMP检测法稳定性测定Note: 1　CCHFV; 2　Hantaan virus; 3　Seoul virus; 4　Marburg virus; 5　severe fever with thrombocytopenia syndrome bunya virus; 6　Ebola virus GP; 7　Ebola virus VPFig.3　Stability test of the visual LAMP assay

2.2实时荧光定量RT-PCR方法检测

2.2.1灵敏度的检测:此次实验同时选用之前报道的qRT-PCR方法对CCHFV进行对比检测，将CCHFV体外转录RNA产物的1010拷贝/μl倍比梯度稀释至10 拷贝/μl，以梯度稀释液作为模板进行扩增，每个拷贝数设3个重复孔，1010至104拷贝/μl有良好的扩增曲线，103和102拷贝/μl扩增曲线重复，且Ct值均大于35，不能判断为阳性，而10 拷贝/μl与阴性扩增线重合，所报道的qRT-PCR方法对本方法CCHFV标准品的检测限为104拷贝/μl。

2.2.2标准曲线的绘制:由于文献报道的qRT-PCR方法对不同CCHFV标准品的检测限不同，为方便对比及定量，选择中间5个点，105、106、107、108、109拷贝/μl拟合绘制标准曲线Y=58.199-4.754×lgX，R2=0.993。

2.3巢式RT-PCR检测将107拷贝/μl 的CCHFV体外转录RNA产物进行10倍比稀释至10 拷贝/μl，以梯度稀释液作为巢式PCR第1轮扩增的模板。以第1轮扩增产物稀释500倍作为模板进行第2轮扩增， 107拷贝/μl-102拷贝/μl模板在200 bp处有扩增，10 拷贝/μl和阴性对照无扩增。

3　讨论

我国首次出现关于CCHF的报道是1965年在新疆巴楚县发生11例出血热，其中10人死亡，由于当时认为病原体是一种新的虫媒病毒，故定名为新疆出血热病毒(Xinjiang hemorrhagic fever virus, XHFV)，后经电镜观察和血清学交叉反应等一系列研究证实，XHFV与CCHFV为同一种病毒。CCHFV属于布尼亚病毒科内罗病毒属，为分节段单股负链RNA病毒，其基因组的3个节段L、M、S分别编码病毒的RNA多聚酶、膜蛋白G1和G2、核衣壳蛋白NP，其中S基因编码的NP为结构蛋白，较为保守。因此，本研究选用国际上通用[9,10]的编码CCHFV保守NP蛋白的S基因作为目的片段建立LAMP反应，保证了对不同CCHFV毒株的检出能力，其他大多数针对CCHFV的核酸检测研究也选择S基因作为检测靶标[7,8,11,12]。构建的重组质粒及体外转录RNA标准品可用于CCHF疫情暴发时的阳性对照。

本研究建立的CCHFV可视化RT-LAMP检测方法具有很好的稳定性，和引起症状相近的病原体如肾综合征出血热汉坦病毒(汉滩型和汉城型)、马尔堡病毒、新型布尼亚病毒、埃博拉病毒(GP蛋白和VP蛋白)无交叉反应，可用于不明原因出血热的鉴别诊断。同时，本方法的最低检测限浓度为10 拷贝/μl，优于Kamboj等[11]报道的TaqMan rRT-PCR的检测限76 拷贝。尽管Atkinson等[7]所建立的qRT-PCR方法的最低检测限可达到5 拷贝，但检出率仅为75%左右，且并不是在所有仪器条件下都可实现，在我们的实验条件下使用其引物探针进行重复，检测限浓度仅达到104拷贝/μl。同样，采用文献报道的巢式RT-PCR引物探针序列[8]进行扩增时，发现该方法的检测限为102拷贝/μl，较LAMP法的敏感性低一个数量级。此外，本研究建立的RT-LAMP方法检出10 拷贝/μl的模板只需30 min，相对于巢式RT-PCR法和qRT-PCR法来说大大缩短了反应时间，且脱离了对精密温控仪器的依赖。

本研究采用HNB显色的方法来判断是否发生了LAMP扩增，其原理为：HNB颜色的变化取决于溶液的pH值，在镁离子浓度为8 mmol/L、不存在dNTPs的情况下，pH值为8.6-9.0时，溶液呈洋红色，当pH值为8.4时，溶液呈蓝紫色；而在溶液中存在dNTPs的情况下，无论溶液的pH值是多少，HNB均呈蓝紫色。由于LAMP反应缓冲液中包含dNTPs，且pH值为8.8，在此条件下，HNB可以用来指示溶液中镁离子浓度的变化。反应开始前，体系中镁离子浓度为8 mmol/L，HNB呈蓝紫色，随着LAMP扩增反应的进行，镁离子浓度逐渐降低，HNB逐渐变为浅蓝色。因此，通过反应前后HNB颜色的变化即可间接判断是否发生了LAMP扩增[13]。虽然Osman等[8]已经利用电泳法和SYBR Green染料法建立了CCHFV的LAMP检测方法，但采用电泳法检测LAMP终点产物不仅耗时、繁琐，且开盖后极易造成气溶胶污染，而使用SYBR Green染料不仅特异性低，还会抑制LAMP扩增反应，降低检测灵敏度[14]。相比之下，本研究采用反应前加入HNB显色剂来肉眼判断LAMP扩增结果的方法不仅可避免开盖污染问题，而且具有高度的敏感性和特异性，相对于其他LAMP产物鉴定方法来说具有明显的优势。

本课题组使用HNB所建立的CCHFV可视化LAMP检测法，仅需一个恒温水浴锅即可在20-40 min内实现对CCHFV的快速检测，在高灵敏度，高特异度的基础上，具备了快速廉价，所需实验条件简单，无需开盖观察结果等诸多优点，然而目前由于疫情地的局限性，尚缺少临床样本进行验证。但本方法的建立适用于条件有限的基层单位和偏远地区，对帮助指导临床及早用药救治患者，降低病死率具有现实意义。

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A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid visual detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus

HanYifang,ZhongJinghao,ZhangChen,ZhangQi,LyuHeng,HuDan,ZhangJinhai,WangChangjun

DepartmentofDiseaseControlandPrevention,ResearchInstituteforMedicineofNanjingCommand,Nanjing210002,China

Correspondingautor:WangChangjun,Email:science2008@hotmail.com;ZhangJinhai,Email:ahoi@163.com

ObjectiveTo develop a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid and visual detection of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. MethodsThe recombinant plasmid containing theSgene of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus was constructed usinginvitrogene synthesis. The most effective primers of the three sets of RT-LAMP primers, designed by Primer Explorer software 4.0, was selected using real-time turbidimetry. Hydroxynaphthol blue (HNB) as the indicator was used to judge the result. ResultsThe result of real-time turbidimetry showed that the first set of primers had the highest amplification efficiency with a peak time of 20 min. The amplification efficiency was accelerated after adding loop primers, of which the peak time was 13min. The detection limit concentration of this method was 10copies/μl with a detection time of 30 min, which was 10-fold and 1000-fold higher than that of nests RT-PCR and quantitative real-time RT-PCR, respectively. This method has great stability. No cross-reactions were observed between Hantavirus, Marburg virus, severe fever with thrombocytopenia syndrome bunya virus, or Ebola virus. ConclusionsThe visual RT-LAMP assay could detect Crimean-Congo hemorrhagic fever virus with less labor and time consuming sensitively and specifically. This lower-cost method could effectively avoid aerosol pollution. It might be applicable for the routine surveillance of Crimean-Congo hemorrhagic fever in unequipped organizations or remote area. Clinical samples are warranted to evaluate the value of this method.

Crimean-Congo hemorrhagic fever; RT-LAMP; Visual detection

王长军，Email: science2008@hotmail.com; 张锦海，Email: ahoi@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.005

国家重大传染病防治专项(2013ZX10004103，2013ZX1004218)；江苏省科技支撑计划(社会发展)项目(BE2013603)；军队重点项目(BWS14J025)

2016-02-18)