北京地区人乳头瘤病毒39型的人群分布特征

纪培丽　姜芬芬　李颖　刘宏图

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒相关肿瘤室(纪培丽、李颖、刘宏图)；100073 北京电力医院妇产科(姜芬芬)



·论著·

北京地区人乳头瘤病毒39型的人群分布特征

纪培丽姜芬芬李颖刘宏图

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒相关肿瘤室(纪培丽、李颖、刘宏图)；100073 北京电力医院妇产科(姜芬芬)

目的研究北京地区人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)39型的感染情况及分布规律。方法收集2013年1月至2014年7月就诊于中国人民解放军总医院妇产科，并在30天内同时进行宫颈脱落细胞HPV分型检测及新柏氏薄层液基细胞学检测的女性患者，回顾性收集其临床信息。通过聚合酶链式反应对HPV39阳性样本进行HPV39病毒基因组全长扩增。结果19 018例受试者中，HPV39阳性为518例，阳性率为2.72%，且在21-25岁组和46-50岁组呈现感染高峰，其阳性率分别为2.98%和2.44%。在宫颈病变中，HPV39在低度鳞状上皮内病变中的阳性率最高，为18.52%。共扩增出5例HPV39阳性样本的病毒全基因组。结论HPV39随年龄增大呈双峰分布，且在低度鳞状上皮内病变中占有较高的比例。宿主细胞中存在附加体形式的HPV39。

【主题词】乳头状瘤病毒，人；阳性率；基因

Fund programs: State Mega-project for Infectious Disease Research of China(2013ZX10004-101)

宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。2012年世界范围内新发病例约为527 600例，约有266 000人死于宫颈癌,占全部女性癌症死亡人数的7.5%[1],其中，85%以上的死亡病例发生在发展中国家。中国国家癌症中心发布的癌症统计数据表明，2011年我国宫颈癌新发病例约8.8万，且超过2万女性死于宫颈癌[2]。

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持续感染是诱发宫颈癌最重要的因子[3]。在宫颈癌中，HPV的阳性率超过80%，有的地区甚至接近100%[4, 5]。根据致癌潜力的不同，HPV分为高危型、疑似高危型和低危型。高危型(high risk, HR)HPV与宫颈癌的发生密切相关。目前已经确认的高危型HPV有15种，HPV39是其中之一。HPV39在宫颈癌中的阳性率为1.3%[6]，有的地区甚至高达5.8%[7]。而且在癌前病变中，它在低级别鳞状上皮内病变中的阳性率较高，为4.1%，占HPV阳性人群的8.90%[7]。

1　对象与方法

1.1研究对象收集2013年1月至2014年7月就诊于中国人民解放军总医院妇产科，并在30 d内同时进行宫颈脱落细胞HPV分型检测及新柏氏薄层液基细胞学检测的女性受试者19 018例，年龄15-89岁，平均年龄41.00±10.96岁。回顾性收集患者的相关临床信息。据细胞学检测结果，其中上皮内病变或恶性病变阴性(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM)17 790例，意义不明确的非典型鳞状上皮细胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)959例，低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)93例，高度鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)176例。本研究经患者知情同意，并通过了中国疾病预防控制中心伦理委员会的批准。

1.2研究方法

1.2.1样品HPV分型检测:采用上海之江生物科技有限公司高危型人乳头瘤病毒(HPV)分型核酸测定试剂盒(荧光PCR法)。该试剂可以针对HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68等13种HR-HPV分型检测。操作步骤及结果判定严格按照其说明书进行。

1.2.2扩增病毒基因组的PCR引物及反应条件:HPV39病毒全基因组的扩增分三段进行，扩增片段大小分别为3 261 bp、3 486 bp和2 424 bp，分别称之为目的片段X、Y和Z，片段X的上下游引物分别为5′-GGACCGCAGACTAACACGAA-3′和5′-ATGCCAGCGTTTTTGGTTCC-3′，包含完整的E7、E1和E4基因。片段Y的上下游引物分别为5′-GGGTGTGTGGACTATTGGGG-3′和5′-TCCTCCACGTGCCTGGTATA-3′，包含完整的E4、E5和L2基因。片段Z的上下游引物分别为5′-GGACTTTGGTGCATTGCAGG-3′和5′-GTCGCAGAGTATCCCGTGAG-3′，包含完整的L1和E6基因。上述扩增引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

使用Ex Taq(大连宝生物)以及厂商推荐条件扩增X、Y和Z 3个片段，使用Qiagen公司(德国)的QIAquick Gel Extraction Kit完成核酸回收。纯化产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

1.3数据分析用Excel 2010进行数据整理及作图，用R进行统计分析，以P<0.05 判定为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HPV39感染情况及比值比分析19 018例受试者中HR-HPV阳性共3 623例，阳性率为19.05%；其中HPV39阳性为518例，阳性率为2.72%。HPV39在HR-HPV中所占的比例为14.30%。在518例HPV39阳性样本中，265例(51.16%)为HPV39单独感染，253例(48.84%)为其他高危型别与HPV39的混合感染。除HPV39之外的其他12种HR-HPV均可与HPV39发生混合感染，其中以HPV68和HPV39的混合感染为最多，共92例(17.76%)，其次为HPV52(5.02%)、HPV58(4.25%)和HPV16(2.70%)。另外，以NILM为对照组，ASC-US、LSIL和HSIL三种宫颈损伤合并为病例组进行比值比(odds ratio，OR)计算，结果表明，HPV16、18、45、56和68等型别与HPV39混合感染的OR值以及三重感染的OR值均大于HPV39单独感染，且P<0.05，差异有统计学意义(表1)。

2.2HPV39在年龄组中的分布在NILM分组 (n=17 790)中，20岁以下的受试者数量仅为85，年龄段分析中没有采用这部分数据。21-60岁之间每5岁作为一个年龄组，大于60岁的归为一个年龄组，因该组涉及年龄跨度大，观察HPV的年龄依存性分布时，60岁以上年龄组仅作为参考。从图1可以看出，HPV39在21-25岁和46-50岁两个年龄段具有较高的占比，分别为2.98%和2.44%，即总体分布呈双峰型，且χ2=20.27，P<0.05，差异具有统计学意义(其余年龄分组的占比数据见图1)。HPV39单独感染和混合感染的年龄分布亦呈现相同的规律，只是其高峰年龄略有差异，且不同年龄组间差异不显著(图1)。

2.3HPV39在宫颈病变中的分布在3 623例HPV阳性受试者中，HPV39在不同宫颈病变中的分布如图2所示。总的HPV39阳性样本在LSIL中有较高占比，为18.52%，高于其他三组，χ2=10.36，P<0.05。但是HPV39单独感染在HPV阳性样本中的阳性率及其在HPV单独感染阳性样本中的阳性率均是随着宫颈病变的加重而逐渐降低。

表1　HPV39感染分布及比值比分析

注：a. 双重感染共计12种，仅以非HPV39的型别表示；b.P<0.05；c.OR值的95%CI包含1.00；d. 由于该项病例组数据为零，所以无法计算OR值

Note:a. There were 12 dual infection，only non-HPV39 type showed；b.P<0.05；c. Ranges ofORs were cross 1.00；d. TheORvalue unavailable due to lack of abnormal samples

图1　HPV39在不同年龄组中的阳性率Fig.1　Age-dependent prevalence of HPV39

图2　HPV39在不同宫颈病变中的阳性率Fig.2　Cytology-dependent prevalence of HPV39

2.4HPV39基因组全长的扩增对5个HPV39阳性样品，我们尝试将病毒基因组分成三段进行PCR以扩增全长。PCR产物的电泳结果显示：这些产物均呈现出单一的条带，且亮度均一。和λE.coliT14 I digest Marker比较，片段X位于3 472 bp稍下面，片段Y位于3 472 bp稍上一点，而片段Z位于2 690 bp下面，因而这些PCR产物应该是预期的3 261 bp、3 486 bp和2 424 bp长度的PCR产物。双边测序确认了以上产物来源于HPV39样本。

3　讨论

HPV持续感染是诱发宫颈癌的必要因子之一，目前已经有超过200种HPV被鉴定出来，但是不同的HPV型别对宫颈上皮的致病性不同，其在不同的国家或地区的流行病学分布亦不相同。因而，了解各地区不同型别HPV的感染现状以及分布规律对控制HPV感染、预防宫颈病变的发生发展具有重要意义。

本研究对北京地区HPV39的感染现状进行调查，结果显示19 018例受试者中，HPV39阳性518例，阳性率为2.72%，在13种HR-HPV中的阳性率为14.30%，明显高于云南的6.73%[8]。提示HPV39是北京地区女性感染的重要HPV型别之一，应在宫颈癌控制中提高重视。值得关注的是，HPV39阳性样本中，48.84%为混合感染。从表1可以看到，只有HPV16、18、45、56、68与HPV39二重感染以及三重感染的危险性高于HPV39单独感染，而HPV52、58与39的二重感染及四重感染并没有表现出更高的危险性。这一现象与HPV52、58和39等型别在HR-HPV具有较低的致癌潜能一致[6]。

HPV感染属于性传播感染，因而HPV在年龄分布上非常不均衡。Dunne等[9]报道，美国女性初交后8-10年，即 20-24岁年龄段，HR-HPV感染率为44.8%，本研究观察到HPV39在该年龄段的高分布特征与这个研究的HR-HPV总体分布规律具有较好的一致性。本研究发现的HPV39另一个感染高峰位于46-50岁组(图1),这一人群的感染高峰可能是由于进入绝经期的女性，激素水平紊乱导致的病毒转归能力下降所致。

HPV是宫颈癌的必要致病因子，从疾病控制的角度看，探讨病毒感染和癌前病变非常重要。本研究发现，随着宫颈病变程度的加重，HPV39在NILM组和ASC-US组阳性率相近，至LSIL组达最高，之后又下降(图2)。与Lurchachaiwong等[10]通过PCR检测E1基因并通过测序分型所得结果类似。高危型HPV的某些基因整合到人基因组被认为是HPV诱发宫颈癌的关键因素。Vinokurova等[11]通过扩增病毒癌基因的转录产物的方法对部分HPV型别的整合状态进行了研究，结果表明，HPV18、45、16、33和31的整合率分别是92%、83%、55%、37%和14%。HPV39的整合问题未见相关报道。本研究中，我们尝试扩增病毒的全基因组，结果显示，5例样本中均存在HPV39的全基因组，提示环状基因组的存在，说明HPV39在这些宿主细胞中存在附加体形式。本研究的后继工作将会着重于整合体的研究。

本研究阐明了北京地区HPV39的感染情况及分布规律，并探讨了HPV在感染细胞中的存在状态，填补了国内HPV39研究的空白。在今后的研究中，我们将更深入的探讨HPV39与宿主细胞的相互作用，进而阐明HPV39在宫颈病变中的作用及致病机制，从而为宫颈癌的防控和筛查提供参考。

致谢：感谢中国人民解放军总医院妇产科为本研究提供样本。

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Distribution characteristics of human papillomavirus type 39 in Beijing

JiPeili，JiangFenfen，LiYing，LiuHongtu

DepartmentofVirusAssociatedTumors,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention，ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention，Beijing102206，China(JiPL，LiY，LiuHT)；DepartmentofObstetricsandGynaecology，BeijingElecticPowerHospital，Beijing100073，China(JiangFF)

LiuHongtu，Email：liuht@chinacdc.cn

ObjectiveTo investigate the infection rate and distribution of human papillomavirus type 39 in Beijing.MethodsHPV genotyping detection coupled with cytological test of cervical exfoliated cells within 30 days were used for the patients from the People′s Liberation Army General Hospital, between January 2013 to July 2014. Full-length genomes were amplified for the HPV39 positive samples.ResultsAmong 19 018 samples, 518 were HPV39 positive (2.72%). Two peaks were observed in the age groups 21-25 and 46-50 years old, with positive rate of 2.98% and 2.44% respectively. The prevalence of HPV39 in low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL) was 18.52%, higher than other cervical lesion groups. In addition, full-length genome amplifications were successful in five HPV39 positive samples.ConclusionsIn the studied population, HPV39 showed two increases in age groups, and abundance in LSIL. Episomal form of HPV39 viral genomes existed in the samples.

Papillomavirus,Human；Prevalence；Gene

刘宏图，Email：liuht@chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.007

重大传染病应急处置检测技术平台(2013ZX10004-101)

2016-04-19)