戊型肝炎病毒ORF3蛋白对人肝细胞CCL13增殖及细胞周期的影响

陈琳　梁玉河　杨晓军　原新慧　刘志武　袁宏　高鹏

730000 兰州大学第一医院传染科(陈琳、原新慧、刘志武、袁宏); 721001 宝鸡市人民医院胸外肿瘤科(梁玉河); 730000 兰州， 甘肃省人民医院普外2科(杨晓军、高鹏)



·论著·

戊型肝炎病毒ORF3蛋白对人肝细胞CCL13增殖及细胞周期的影响

陈琳梁玉河杨晓军原新慧刘志武袁宏高鹏

730000 兰州大学第一医院传染科(陈琳、原新慧、刘志武、袁宏); 721001 宝鸡市人民医院胸外肿瘤科(梁玉河); 730000 兰州， 甘肃省人民医院普外2科(杨晓军、高鹏)

【主题词】肝炎病毒，戊型；ORF3蛋白；增殖；细胞周期

Fund programs: Youth Fund of Gansu Provincial Sci.& Tech. (145RJYA247)；National Natural Science Fund of China(81260326)

戊型病毒性肝炎(戊肝)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)感染而引起的急性传染病，主要经消化道传播。戊肝虽是自限性疾病，但其病死率高于甲型与乙型肝炎，在孕妇中的病死率甚至可高达20%-30%[1]。近年来戊肝病例在我国呈上升趋势，据统计，截至2009年戊肝在急性病毒性肝炎中所占比例已由8.85%上升至31.62%[2]。HEV为单股正链RNA，全长7.5 kb，基因组包含3个相互重叠的开放读码框(ORF)；ORF1编码与病毒基因组复制有关的非结构蛋白；ORF2编码病毒的结构蛋白；ORF3编码一种磷酸化的蛋白，此蛋白可能在信号转导、病毒颗粒装配及释放中起重要作用[3-5]。然而，由于病毒在体外的大量复制难以实现，使得针对ORF3编码蛋白的相关功能研究受到限制。

在前期研究中，我们成功构建了真核表达载体pDsRed-Monomer-N1-ORF3，转染BHK-21细胞，检测ORF3蛋白的表达及在细胞中的定位，为HEV ORF3的功能研究奠定了基础[6]。本研究中，我们进一步将真核表达载体pDsRed-Monomer-N1-ORF3，转染至人张氏肝细胞Changliver(CCL13)，研究其对人肝细胞增殖及细胞周期的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞及载体:人张氏肝细胞(Changliver,CCL13)为甘肃省人民医院实验中心冻存复苏，最初购自中国科学院上海细胞库；真核表达质粒pDsRed-Monomer-N1-ORF3为本室构建，构建方法参见文献[4]。

1.2方法

1.2.2MTT检测细胞增殖：3组CCL13细胞，包括未转染(Blank)组、空质粒(Control)转染组以及ORF3质粒(ORF3)转染组，分别接种于96孔细胞培养板。加入RPMI1640培养基200 μl。检测时间点为接种后1、2、3、4、5、6 d，检测前每孔加入培养基180 μl、5 mg/ml MTT 20 μl、37 ℃孵育4 h后吸弃孔内上清，每孔加DMSO 150 μl，振荡10 min，酶联免疫监测仪490 nm测定光吸收值，记录结果绘制细胞生长曲线。

1.2.3流式细胞仪检测细胞周期：3组CCL13细胞分别接种于6孔细胞培养板，孵育48 h，离心收集细胞并用300 μl PBS 重悬，加入1 ml 0 ℃预冷无水乙醇振荡，-20 ℃冰箱过夜固定。次日1 500 rpm 离心10 min，弃上清，1 ml PBS 重悬，室温15 min。再次1 500 rpm 离心5 min，弃上清，依次加入100 μl PBS、5 μl RNaseA、300 μl 碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混匀后避光温浴30 min，上机检测细胞周期。

1.2.4蛋白印迹法(Western-Blot)检测细胞周期素的表达：收集融合度70%-80%左右、处于对数生长期的三组细胞(Blank、Control、ORF3)，使用总蛋白提取试剂(含PMSF的RIPA)提取蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。加入蛋白缓冲液，100 ℃变性5 min 后-80 ℃冻存。取蛋白样品30 μg进行SDS-PAGE，15%分离胶分离蛋白，浓缩胶为4%。PVDF转膜，含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭2 h，洗膜，加I抗(兔抗人Cyclin Dl、Cyclin E1、CyclinA2、CyclinB1及GAPDH抗体，抗体浓度1∶500-1 000) 4 ℃过夜，孵育后洗膜，加II抗(羊抗兔IgG II抗，抗体浓度1∶2 000) 4 ℃孵育4 h。用化学发光法显色分析目的蛋白表达情况，GlyKo Bandscan 5.0软件系统(Glyko Inc,USA)分析目标条带。

A：ORF3质粒转染CCL13细胞24 h；B: ORF3质粒转染CCL13细胞48 h；C：空质粒转染CCL13细胞24 h；D：空质粒转染CCL13细胞48 h图1　真核表达质粒pDsRed-Monomer-N1-ORF3成功转染A: 24 h after ORF3 plasmid transfected into CCL13; B: 48 h after ORF3 plasmid transfected into CCL13; C: 24 h after empty plasmid transfected into CCL13; D: 48 h after empty plasmid transfected into CCL13 Fig.1　Eukaryotic expression plasmid pDsRed-Monomer-N1-ORF3 transfected into CCL13 cell

2　结果

2.1真核表达质粒pDsRed-Monomer-N1-ORF3及空质粒pDsRed-Monomer-N1成功转染CCL13细胞在荧光倒置显微镜下，转染pDsRed-Monomer-N1-ORF3质粒(ORF3组)及空质粒(对照组)后24 h、48 h的CCL13细胞能看到特异性的红色荧光表达，说明质粒转染成功(图1)。

2.2ORF3蛋白对CCL13细胞增殖的影响细胞培养1-6 d，MTT法检测对照组和空白组细胞增殖速度相近，无显著差异；而ORF3组细胞与空白组细胞相比较，在培养第1-3天，细胞增殖速度差异无统计学意义(P>0.05)；从第4天开始至第6天，ORF3组细胞增殖明显受抑，两组相比，差异具有统计学意义(图2，P<0.05)。

A：MTT结果；B: MTT结果定量分析(*P<0.05)图2　ORF3蛋白对CCL13细胞增殖的影响A: MTT results; B: Quantitative analysis for MTT results(*P<0.05)Fig.2　Effect of ORF3 protein on proliferation of CCL13 cell

2.3ORF3蛋白对CCL13细胞周期的影响三组细胞中G0/G1期细胞量最多；ORF3组的细胞周期主要分布于G0/G1期，与空白相比(67.35±5.03% vs 55.34±5.12%，P<0.05)，有统计学意义；对照组(58.63±4.23%)与空白相比(55.34±5.12%)，细胞周期不同阶段的分布均无统计学意义(图3)。

2.4ORF3蛋白对CCL13细胞周期素的影响

与对照组及空白相比， ORF3组细胞中细胞周期素Cyclin Dl及Cyclin E1的表达减少，而和G2期相关的细胞周期素Cyclin A2及CyclinB1的蛋白表达水平无差异(图4)。

A：流式细胞仪检测结果；B: 定量分析(*P<0.05)图3　ORF3蛋白对CCL13细胞周期的影响A: FCM results; B: Quantitative analysis for FCM results(*P<0.05)Fig.3　Effects of ORF3 protein on cell cycle of CCL13 cell

图4　ORF3蛋白对CCL13细胞周期素的影响Fig.4　Effects of ORF3 protein on the expression of cycling in CCL13 cell

3　讨论

病毒为了利于自身复制往往会影响宿主的细胞周期，其中关于DNA病毒调控宿主细胞周期的相关研究较多。如腺病毒[7,8]、人乳头瘤病毒(HPV)[9]自身缺乏多聚酶，因此可以编码一些细胞周期调控蛋白，促使细胞进入S期从而利于病毒自身基因组合成。此外，一些较大的DNA病毒，如疱疹病毒则是通过诱导细胞周期阻滞G0/G1期，避免和宿主细胞进行DNA合成的竞争而利于病毒自身复制[10]。近年来，有关RNA病毒对宿主细胞周期影响的研究也逐渐增多：如隶属于冠状病毒家族的感染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)能够诱导宿主细胞G2/M期阻滞[11]，鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)和严重的SARS病毒能够诱导宿主细胞阻滞于GO/Gl期。

至于HEV ORF3蛋白的功能研究，王晶晶等[12]在肝癌细胞系Huh7中的研究证实：ORF3蛋白可以阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制Huh7细胞的增殖活性；赵振宇等[13]在肝癌细胞系HePG2中细胞转染重组质粒表达HEV-ORF3蛋白后，发现HEV-ORF3蛋白可通过PI-3K-Akt信号转导通路激活NF-κB，使其从细胞浆转位到细胞核，发挥转录调控作用，提示HEV感染人体后的肝细胞损伤可能与NF-κB活化后的炎症反应有关。但是，这些研究选用的都是肝癌细胞系，不能完全代表HEV在正常肝细胞中的情况。

CCL13是在人正常肝细胞原代培养的基础上经一定的处理而能连续传代，且保留有正常肝细胞特征和超微结构的肝细胞。已有学者在对丙型肝炎病毒的功能研究中采用CCL13细胞并取得满意效果[14]，因此我们认为在对HEV的研究中，CCL13肝细胞株是一种非常理想的细胞株。

在本研究中，我们采用本室构建的真核表达质粒pDsRed-Monomer-N1-ORF3，成功转染CCL13，转染效率达90%以上。MTT实验结果表明ORF3蛋白可以使CCL13细胞增殖受抑；通过细胞周期检测，我们发现ORF3组的细胞周期主要分布于G0/G1期；Western-Blot的实验结果证实ORF3组细胞中细胞周期素Cyclin Dl及Cyclin E1的表达减少，这正是细胞周期停滞于G0/G1期的原因。本实验的结果与前述王晶晶等在肝癌细胞系Huh7中的研究结果相符[12]，我们由此推断HEV可能也是通过阻滞细胞周期于G0/G1期，从而促进其自身的复制，而达到在宿主体内长期存活的目的，这种功能可能是由0RF3蛋白来实现的。

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[3]Tyagi S, Korkaya H, Zafrullah M, et al. The phosphorylated form of the ORF3 protein of hepatitis E virus interacts with its non-glycosylated form of the major capsid protein, ORF2[J]. J Biol Chem, 2002, 277(25): 22759-22767. doi: 10.1074/jbc.M200185200.

[4]佟玉品,毕胜利,鲁健,等. 酵母表达的重组戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白的抗原性鉴定[J]. 中华实验和临床病毒学杂志,2003,17(3):259-261. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2003.03.015.

[5]佟玉品,詹美云,鲁健,等. 酵母表达的戊型肝炎病毒结构区ORF2蛋白的免疫原性研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志,2002,16(1):23-26. doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2002.01.006.

[6]陈琳，杨晓军，袁宏,等.型肝炎病毒ORF3真核表达载体的构建及在BHK-21细胞表达[J].中华肝脏病杂志,2014,22(7):499-503. doi:10.3760/cma.J.issn.1007-3418.2014.07.005.

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Effects of hepatitis E virus open reading frame 3 protein on the proliferation and cell cycle of Chang liver cells

ChenLin,LiangYuhe,YangXiaojun,YuanXinhui,LiuZhiwu,YuanHong,GaoPeng

DepartmentofInfectiousDisease,TheFirstAffiliatedHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China(ChenL,YuanXH,LiuZW,YuanH);DepartmentofThoracicOncologySurgery,ThePeople′sHospitalofBaojiCity,Baoji721000,China(LiangYH);DepartmentofGeneralSurgery,GansuProvincialHospital,Lanzhou730000,China(YangXJ,GaoP)

YangXiaojun,Email:yangxjmd@aliyun.com

ObjectiveTo study the effect of hepatitis E virus Open Reading Frame 3 protein on the proliferation and cell cycle of Chang liver cells (CCL13). MethodsThe pDsRed-Monomer-N1-ORF3 recombinant plasmid was transfected into CCL13 cells via lipofectamine 2 000 reagent, then assayed cell proliferation by MTT assay; Flow cytometric was used to detect cell cycle after dying with PI; and the cell cycle proteins expression were detected by western-blotting. ResultspDsRed-Monomer-N1-ORF3 recombinant plasmid was successfully transfected into CCL13 cells, Expression of ORF3 can inhibit the proliferation activity of CCL13 cells from the 3rdday (P<0.01), and prevent the cell cycle in G0/G1 phase; Western Blot showed expression of cell cycle proteins cyclin D1 and cyclin E1 were decreased in ORF3 group compared with the control group; However, the expression of cyclin A2 and cyclin B1 had no significantly difference in three groups. ConclusionsHEV-ORF3 can inhibits the proliferation activity of CCL13 cells by inhibition expression of cell cycle proteins cyclin D1 and cyclin E1.

Heptitis E; ORF3; Proliferation; Cell cycle

杨晓军， Email: yangxjmd@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.04.009

甘肃省青年科技基金计划(145RJYA247)；国家自然科学基金(81260326)

2016-01-24))