硒砂瓜连作地微生物群落变化及一株优势芽孢杆菌的分离鉴定

岳思君，李海荣，武珍珍，郑 蕊，周 娟，苏建宇

（1.西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室·宁夏大学生命科学学院 银川 750021；2.宁夏民族职业技术学院 宁夏吴忠 751100）

砂田是在土地表面覆盖厚度为7～20cm不同粒径的砾石、砂或卵石后形成的特殊类型的土地，压砂种植是中国西北干旱、半干旱地区的农民经过长期耕作实践形成的一种抗旱、抗风蚀的耕作方式，有增温、蓄水、保墒等作用[1-2]。中卫市沙坡头区位于宁夏中部干旱带，其环香山地区占全市面积的1/3。该地区干旱少雨，年降水量仅为189.5 mm，蒸发量却为2 400 mm，沙砾遍地，昼夜温差大，自然条件恶劣[3]。2004年以来，当地政府根据本地的气候及种植条件，采用压砂种瓜这一节水保墒的旱作农业种植模式。压砂瓜种植规模迅速扩大集中在中卫市沙坡头区、中宁县和海原县。到2012年压砂瓜种植面积连续5年稳定在6.67万hm2以上，已形成了压砂瓜产业区域化、规模化发展格局[4-5]。压砂西瓜中含有0.005 6 mg·kg-1硒元素，有延年益寿、抗衰老、抗癌的作用，独具保健价值，因而得名为硒砂瓜[6]。用传统压砂抗旱法种植的硒砂瓜，以其品质好、无污染而备受客商和消费者青睐。

硒砂瓜主要种植模式为连作地种植，由于盲目施用农药和化肥，造成土壤生态环境恶化，硒砂瓜产量下降，品质变劣，连作障碍严重，不仅严重影响了硒砂瓜产业的可持续发展和食品安全，而且威胁着消费者的健康。因此创造一个有利于生产的环境已成为一个急需解决的问题。连作障碍发生与土壤传染性病害、土壤理化性状劣变以及由根系分泌物和残茬分解物等引起的自毒作用等有关，而这些因子均不同程度与土壤中的微生物有关[7-9]。多数学者认为连作引起土壤微生物区系发生了较大的变化，土壤微生物是连作障碍的主要因子之一，其群落结构组成及其变化在一定程度上反映了土壤的质量及其健全性[10-12]。为寻求安全有效的防治措施，生物防治越来越引起人们的关注。本文以不同连作年限的硒砂瓜种植区土壤微生物作为研究对象，了解硒砂瓜连作地微生物种类和数量变化规律，在此基础上，对1株芽孢杆菌做了分类鉴定，以期用于连作障碍的生物防治。通过调节土壤的环境条件和改善它的微生物区系，从而发挥有益微生物的作用，降低有害微生物对土壤的影响，促进土壤培肥，为解决硒砂瓜产业种植过程中出现的连作障碍问题以及构建硒砂瓜可持续发展的技术体系提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

土样取自宁夏中卫市兴仁乡硒砂瓜种植区，依据瓜田连作年限不同，将连作瓜田划分为连作1a、3a、5a、7 a和10 a共5个等级分别取样。采用5点取样法来，采集15cm左右土层的土壤，每个样点取0.5 kg左右土样，装入密封袋中保存备用。

1.2 微生物分离方法

分别取不同年限的待测硒砂瓜土壤样品1g，放入盛有9 mL蒸馏水的灭菌试管内，将试管放入摇床内经过充分振摇，制成1∶10的均匀稀释液。按照10倍稀释法依次制成不同浓度梯度的稀释液。以涂布平板法计数，取稀释度为 1×103～1×105土壤悬浮液各100μL，分别接种于灭菌后的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基和高氏一号培养基。每个浓度3次重复，细菌培养恒温28℃培养3d，真菌培养恒温25℃培养5d，放线菌28℃下培养7d后计数，结果以每g干土所含数量表示。选取每皿菌落数为15～150的稀释度统计菌落数量，按下列公式计算菌落数量：菌落数量/（cfu·g-1）=（菌落平均数×稀释倍数）/干土质量。

1.3 细菌的形态特征和培养特征

将优势细菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上,28℃培养,观察18～24 h的菌落形态。挑取单菌落进行革兰氏染色,并观察菌体形态。

1.4 细菌的生理生化特性测定

采用生物梅里埃（biomerieux）Vitek32-BCL鉴定卡片进行数值法鉴定。

1.5 16SrDNA的PCR扩增与序列测定

提取细菌DNA，然后采用通用引物27f/1492r通过PCR扩增16SrDNA序列[11]。引物序列为27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR 反应体系（25μL）：2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，27f（10 mol·L-1）0.5μL，1492r（10 mol·L-1）0.5μL，DNA 1μL，ddH2O 补至 25μL。PCR 反应程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72℃10 min。扩增产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后，与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞E.coliDH5α，选取阳性克隆测序，测序由上海生工基因公司完成。将测序结果在NCBI网站上用BLAST软件与GenBank核酸数据库中相关种属的16SrDNA序列进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 硒砂瓜不同年限连作土壤微生物群落变化规律

因为不同连作年限硒砂瓜土壤的根系分泌物、残留在土壤中的植株，以及栽培管理方法都是相同的，这样就形成了特定的连作硒砂瓜土壤微生物区系。随着连作年限的增加，真菌的数量逐渐增加，而细菌和放线菌大量减少（表1）。可以看出，在连作3 a后，土壤中的真菌数量比1年土壤增加了39.13%；连作5 a，土壤中真菌数量比1年土壤增加了65.21%；连作10 a土壤中真菌数量较1 a土壤增加了130.43%。对于放线菌，连作3 a，土壤中的放线菌数量较1 a土壤减少了35.56%，连作7 a就会减少50%以上。对于细菌，连作3 a，较1 a土壤减少了16.67%；连作7 a，就会较1 a土壤来说减少48.15%；连作10 a较1 a土壤来说减少了66.67%。上述结果表明，土壤微生物内，各个类群之间的平衡发生了非常大的改变。1 a土壤中的细菌与真菌的比值为235，而连作3 a，其比值就减小到了141。由此可见，连作会使土壤由细菌型转向真菌型，最终导致地力衰竭，硒砂瓜生长不良，植株矮小，产量也会受到极大的影响。

表1 硒砂瓜不同年限土壤微生物区系

图1 NB1菌落形态

2.2 NB1菌落形态及显微镜观察

NB1细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上培养以后，其菌落形态如图1所示，菌株呈不规则的圆形，不透明，表面干燥，菌落表面有褶皱，边缘不整齐。NB1菌株的革兰氏染色结果如图2所示，结果显示，该细菌染色后颜色为紫色，形态呈杆状，故初步判定菌株NB1为革兰氏阳性菌（G+），为典型的芽孢杆菌。

2.3 NB1菌株的生理生化鉴定

对NB1菌进行生理生化鉴定（表2），检测结果表明该细菌与枯草芽孢杆菌的相似性为87%，判断其为枯草芽孢杆菌。

图2 NB1革兰氏染色（10×100倍）

表2 法国梅里埃VITEK-2型全自动微生物鉴定分析系统鉴定结果

2.4 NB1菌株的分子鉴定

2.4.1 NB1菌株的16SrDNA基因序列测定 利用细菌基因组提取试剂盒，提取NB1菌株的基因组DNA。经过1%的琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度和片段大小，细菌的总长度为15 kb左右，结果如图3所示。

图3 NB1菌基因组DNA电泳结果

2.4.2 NB1菌株16SrDNA全长PCR扩增 利用细菌通用引物，扩增NB1菌株16SrDNA全长，扩增产物用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增长度大概在1 500 bp左右（图4）。

图4 NB1菌株PCR扩增电泳结果

2.4.3 NB1菌株16SrDNA序列相似性比较 通过DNAMAN软件分别将NB1菌株序列和其相似的各个序列进行多重比对，发现NB1菌株序列与Bacillus subtilis strian MX-1、Bacillus subtilis strainsubsp.stain DDKRC2和Bacillus licheniformis strain Dou6的16SrDNA序列的相似性均达到99%。因此依据16SrDNA序列同源性，并结合菌株的形态、生理生化特征等综合分析，最终将该菌株确定为枯草芽孢杆菌。

3 讨 论

关于连作障碍形成及加剧的原因是比较复杂的，导致其发生的因素较多且又相互影响，是植物-土壤系统内多种因子综合作用的结果。研究认为作物连作后，微生物种群受到严重破坏，主要微生物数量和土壤酶活性不同程度的下降[13-14]。本研究结果发现，不同连作年限下，土壤中三大微生物类群的组成比例大体一致，即细菌最多，放线菌次之，真菌最少。硒砂瓜连作土壤由于同一类根系分泌物持续释放，形成了特定土壤环境和根际条件，导致土壤微生物种类与数量变化,即细菌、放线菌数量下降，真菌数量升高，微生物区系从细菌型土壤向真菌型土壤转化。一般认为真菌型土壤是地力衰竭的标志，真菌数量增加，意味着病害加重[2]。

利用微生物进行土壤生态修复、改变土壤微生物种群结构、重建土壤微生物系统动态平衡，已成为克服土壤连作障碍的重要手段，越来越引起重视。芽孢杆菌属是革兰氏阳性菌，能产生耐热、耐旱、耐有机溶剂和抗紫外线的内生芽孢。除了具有与其他生防菌相似的优势外，因能产生抗逆性强的芽孢因而极易在逆境条件下生存。芽孢杆菌类的生防菌剂也广泛应用于农业生产中的植物病虫害防治。枯草芽孢杆菌是一种研究较多的生防菌，其能够产生伊枯草菌素等抗生素类物质抑制植物致病真菌的生长[15-16]，而且枯草芽孢杆菌在施入植物根围后，能在植物的根际表面形成一层结构稳定的致密菌膜以防止致病菌的入侵[17]。关于枯草芽孢杆菌对植物致病菌防治方面的研究很多，芽孢杆菌类生防菌对丝核菌以及尖孢镰刀菌有极强的抑制作用并且对由这些致病菌引起的番茄、马铃薯、黄瓜等作物的枯萎病有一定的防治效果。一些研究者还发现，由于其具有产生抗生素的特性，也可以用于采摘后水果的保鲜[18]。笔者通过对硒砂瓜连作地中分离出的一株优势芽孢杆菌NB1菌株的鉴定，为进一步探究其对硒砂瓜连作地的影响、改善土壤菌群结构、提高硒砂瓜产量提供优良菌种。

4 结论

从不同连作年限的宁夏硒砂瓜种植区采集土样进行活菌计数，结果表明，土壤微生物区系发生了较大的变化，随着连作年限的增加，真菌的数量逐渐增加，而细菌和放线菌大量减少，连作会使土壤微生物由细菌型转向真菌型。

硒砂瓜连作地中分离得到1株优势芽孢杆菌NB1，通过形态特征、生理生化反应结合16SrDNA基因序列分析，初步鉴定NB1菌株为枯草芽孢杆菌。为进一步研究其拮抗性能和对连作地土壤效应奠定基础。