北京大气PM2.5对A549细胞炎性因子及DNA损伤的毒性

焦周光,付绪磊,温占波*,李劲松*,李 娜,张 柯,王 洁,胡凌飞



北京大气PM2.5对A549细胞炎性因子及DNA损伤的毒性

焦周光1,付绪磊2,温占波1*,李劲松1*,李 娜1,张 柯1,王 洁1,胡凌飞1

(1.军事医学科学院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全国家重点实验室,北京 100071；2.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁 锦州 121013)

为探讨大气PM2.5及其不同组分对人肺上皮细胞A549的毒性作用及其剂量-反应关系,将前期采集的PM2.5颗粒物用不同方法进一步制备PM2.5水溶性组分、PM2.5脂溶性组分和PM2.5单纯颗粒物,将制备的PM2.5颗粒物及其组分以不同浓度对A549细胞染毒,用MTS法分别在染毒6, 10, 24, 48, 72h后测定细胞活力,染毒24h后用ELISA及RT-QPCR法测定IL-6和TNF-α表达量,AP位点计数法测定细胞DNA损伤情况.结果表明: 除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本高浓度染毒时始终对细胞生长表现出抑制作用,其中低浓度染毒时可在较短时间对细胞生长表现出抑制作用,染毒时间较长时抑制作用减弱或消失,PM2.5水溶性组分对细胞生长抑制作用并不显著;除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本都显著升高了IL-6mRNA的相对表达量和IL-6蛋白的分泌,除PM2.5脂溶性组分外,其余染毒样本都显著升高了TNF-α mRNA的相对表达量;除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本都显著提高了DNA碱基缺失程度.总的来说,PM2.5水溶性组分在抑制细胞活力、造成炎性损伤及DNA损伤方面作用相对较小,而PM2.5所产生的毒性作用并不仅限于其所吸附的复杂成分,其中作为载体的固体核心颗粒对机体可能造成的毒性作用也不容忽视.

PM2.5；组分；A549；细胞活力；炎性因子；DNA损伤

PM2.5粒径小,比表面积大,能够吸附大量的毒害物质,可以深入支气管及肺泡,因而对人体健康影响巨大[1-3].流行病学调查表明,以PM2.5为主的空气颗粒物污染可以导致呼吸系统疾病、心血管系统疾病及人群过早死亡的发生[4-7].由于有害的空气污染物主要在肺表面释放并吸附于肺上皮细胞,因而肺脏,尤其是肺上皮细胞被认为是吸入颗粒物的主要生物靶目标[8-9].PM2.5来源广泛,其吸附的各种化学组分成分复杂[10],有研究表明PM2.5吸附的有机化合物和无机组分与其生物学效应密切相关[11-13],此前已有研究人员对PM2.5的水溶性组分和脂溶性组分的生物毒性作用进行了有益的探索[10,14-18],但对其以碳质为主的固体组分的生物毒性研究多以碳黑来代替[19-20],并不能完全代表其单纯固体组分的生物毒性作用,因而对于由PM2.5造成的疾病损伤其吸附成分和固体组分哪个损伤作用更大尚值得探讨.本研究采集了北京城区大气PM2.5颗粒物样本,并在PM2.5颗粒物样本(文中将洗脱下来的PM2.5称为PM2.5完全颗粒物)的基础上另外制备了PM2.5水溶性组分、PM2.5脂溶性组分及PM2.5单纯颗粒物(主要成分为PM2.5中的不溶性固体组分),以人肺上皮A549细胞为研究对象,使用PM2.5颗粒物及其不同组分样品对A549细胞染毒,并从细胞活力、炎性损伤及DNA损伤三方面来评估及比较各染毒样本对A549细胞染毒后对研究对象所产生的毒性作用.

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

PM10/PM2.5大流量采样器(Thermo),石英滤膜(PALL),B2200S超声清洗器(上海必能信超声有限公司),3-18K低温离心机(Sigma),冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司),CO2培养箱(NUAIRE),CK40倒置显微镜(OLYMPUS),MK-3酶标仪(Thermo),0.2μm滤器(PALL),荧光定量PCR仪(Roche),DMEM高糖培养基(GIBCO),胎牛血清(PAN),MTS试剂(Promega),胰蛋白酶(Amresco),炎性损伤指标测定试剂盒(IL-6、TNF-α,武汉博士德生物有限公司),DNA提取试剂盒(TAKARA),RNA提取试剂盒(TAKARA), STBR GreenⅠ荧光染料(TAKARA),损伤定量试剂盒-AP位点计数(日本同仁化学研究所).

1.2 颗粒物的采集

采样地点位于北京城区西南三环到四环之间,靠近东大街和丰管路,周边交通流量较大且分布有文体机构、大型商场及各类机关单位,无工业污染源,采样器距离地面约18m,采集的PM2.5颗粒物可较好代表北京城区情况.采用PM10/ PM2.5大流量采样器连续采样30d(2014年5月28日~2014年6月26日),采用PM2.5切割头采集PM2.5样本,采样流量为1.13m3/min,每23.5h换一次采样滤膜.采样滤膜为(8×10)英寸的石英滤膜,采样前被置于马弗炉中600℃灼烧2h以除去可能存在的有机物质,采样后将滤膜置于-20℃冰箱保存备用.

1.3 PM2.5完全颗粒物及不同组分的制备

采样结束后,将吸附有颗粒物的滤膜剪成1cm2左右小块并置于超纯水中超声震荡2.5h(超声4.5min,停5min,依次循环,使水温保持在20℃以下),超声结束后将滤膜吸附的水挤出后经六层纱布过滤至100mL玻璃瓶,-20℃冷冻后经冷冻干燥即可得PM2.5完全颗粒物[21].

依据相关文献[22],另外制备PM2.5水溶性组分及PM2.5脂溶性组分.PM2.5水溶性组分制备方法:将适量PM2.5完全颗粒物置于超纯水中,充分震荡后以5000r/min低温离心5min,用0.2μm滤器过滤上清液可得PM2.5水溶性成分的水溶液,将其冷冻干燥后可得PM2.5水溶性组分;PM2.5脂溶性组分制备方法:将适量采样后滤膜剪成小块后用滤纸包好并置于索氏提取器用二氯甲烷萃取即得PM2.5脂溶性组分的有机溶液,于通风橱中挥发掉二氯甲烷后可得PM2.5脂溶性组分.将PM2.5完全颗粒物高压灭菌并分别去除水溶性组分、脂溶性组分后将剩余颗粒物经180℃高温烘烤3h即可得到PM2.5单纯颗粒物.

1.4 细胞培养

人肺上皮细胞A549(军事医学科学院)用含10%胎牛血清和双抗(青链霉素各100U/mL)的DMEM培养基,于37℃、5% CO2条件下培养,当细胞融合至80%时用0.25%胰蛋白酶消化、传代及用于试验.

1.5 各染毒样本染毒母液制备

分别称取适量PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物用不含血清(含双抗)的DMEM培养基制备16mg/mL的染毒母液备用(4℃存储,72h内使用),根据制备的PM2.5水溶性组分质量用无菌生理盐水配制成100mg/mL的染毒母液备用(4℃存储),PM2.5脂溶性组分用二甲基亚砜(DMSO)配制成100mg/mL的染毒母液备用,方法与水溶性组分制备方法类似.

将PM2.5完全颗粒物、PM2.5水溶性组分、PM2.5脂溶性组分及PM2.5单纯颗粒物染毒母液在使用前用细胞破碎仪超声裂解5min,依次取适量各染毒母液加入10%胎牛血清细胞培养基使各染毒样本染毒液浓度为400μg/mL,在400μg/ mL的基础上再进一步稀释为200, 100, 50, 10μg/ mL,PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物以无血清培养基为溶剂对照,PM2.5水溶性组分以生理盐水为溶剂对照,PM2.5脂溶性组分以DMSO为溶剂对照.

1.6 细胞毒性试验

将处于对数生长期的A549细胞消化后稀释为5×104/mL的细胞悬液,将细胞悬液以100μL/孔接种于96孔细胞培养板,置于37℃、5% CO2培养箱培养24h后弃上清,溶剂对照, 10, 50, 100, 200, 400μg/mL)染毒液以100μL/孔分别加入96孔细胞培养板,另外设定无细胞无染毒液的空白对照孔,每个浓度设定5个平行孔,分别培养6, 10, 24, 48, 72h后,弃上清,用PBS洗3遍,每孔加入100μL新鲜培养基和20μL MTS试剂,继续培养3.5h后,用酶标仪于492nm处测定其OD值,各处理组的OD值能代表测定时细胞的活力.另外,计算染毒后相比于溶剂对照组的细胞存活率,细胞存活率(%)=(OD实验-OD空白)/(OD对照-OD空白)´100%.

1.7 炎性损伤指标的测定

将处于对数生长期的A549细胞消化后以3×105/孔接种于6孔板培养,每孔3mL培养基,于37℃、5% CO2培养箱培养24h后弃上清,将各染毒样本的不同浓度组(溶剂对照, 10, 50, 100, 200, 400μg/mL)染毒液以3mL/孔分别加入6孔细胞培养板培养24h.

1.7.1 炎性因子IL-6、TNF-α的分泌量检测 将染毒结束后的细胞培养上清以3000r/min离心15min后留上清,用ELISA法按照相应试剂盒操作说明书通过酶标仪于450nm处测定各孔的吸光度值,然后根据标准品吸光度值绘标准曲线进而计算各处理组培养上清中IL-6、TNF-α的浓度,试验时每种处理设定3个平行孔;

1.7.2 炎性因子IL-6、TNF-α的mRNA表达量检测 对染毒后细胞采用RT-QPCR技术(SYBR GreenⅠ法)检测细胞因子mRNA的表达,按照相关试剂盒使用说明书,首先提取RNA后,经过RT反转录,荧光定量PCR法检测mRNA的表达,每种处理设定三个平行孔.选取甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,内参所用引物参照文献[23]设计,根据IL-6和TNF-α的mRNA序列(GenBank序列号依次为: NM_000600.4、NM_000594.3)利用Primer Premier 5.0设计引物,引物由北京博迈德公司合成.GAPDH引物序列为正义链:CCATGGAGAAGGCTGGGG,反义链:CAAAGTTGTCATGGATGACC;IL-6引物序列为正义链:GAGTAACATGTGTGAAAGCAGC,反义链:CCAGGCAAGTCTCCTCATTGAATCC; TNF-α序列为正义链:ACCACGCTCTTCTG- CCTGCTG,反义链:GAGGGTTTGCTACAACA- TGG;扩增产物GAPDH、IL-6、TNF-α片段长度分别为194, 116, 157bp.PCR反应程序在荧光定量PCR仪上进行,扩增条件为:预扩增95℃ 30s;然后95℃ 5s,60℃ 40s,40个循环,每个循环检测一次荧光变化;做熔解曲线95℃ 0s, 20℃/s,65℃ 15s, 20℃/s,95℃ 0s, 0.1℃/s,整个过程连续检测荧光变化,熔解曲线可用于验证扩增是否具特异性.根绝内参C值,利用2-DDCt法计算各处理组目的基因的表达量相当于溶剂对照组的倍数.

1.8 染毒后细胞DNA损伤测定

细胞培养及染毒方式同炎性因子指标测定时的培养方法.染毒24h后,弃上清,根据试剂盒使用说明书对染毒后的细胞提取DNA,然后用微量分光光度计对提取的DNA浓度进行检测,并用TE buffer调节DNA浓度为100μg/mL,然后根据DNA损伤定量试剂盒操作说明对提取的DNA碱基缺失情况进行测定,用酶标仪在630nm处测定各孔吸光度值,根据标准曲线可以计算出每种处理造成的DNA碱基缺失个数(个/105碱基),每种处理设定3个平行孔.

1.9 统计与分析

先采用Excel 2010绘制标准曲线及整理数据,然后用SAS 9.2软件进行统计学处理,试验结果以“平均数±标准差”表示并作柱状图,采用析因设计的分析方法对各因素的影响进行统计学分析,统计检验水准<0.05时差异有统计学意义.

2 结果

2.1 不同浓度PM2.5各样本对A549细胞染毒后活力及存活率变化

2.1.1 不同浓度PM各样本对A549细胞活力的影响 如图1所示,随着时间的延长,各染毒组细胞活力总体都呈现增长的趋势,但除水溶性组分外,其余样本高浓度染毒时都表现出了比低浓度组更强的抑制细胞生长的作用.PM2.5完全颗粒物染毒6h时低浓度染毒组(10, 50μg/mL)即表现出对细胞生长的抑制作用,染毒组细胞活力显著低于溶剂对照组,染毒48h及以后低浓度染毒组对细胞生长不表现出抑制作用,而较高染毒浓度组(100μg/mL及以上)始终表现出较强的抑制细胞生长的作用;PM2.5单纯颗粒物在染毒6h时即对细胞生长表现出抑制作用,10h时对细胞生长的抑制作用有所缓解,而后又都表现出毒性作用,至染毒72h时,低浓度染毒组(10, 50μg/mL)对细胞生长抑制作用消失,高浓度染毒组始终对细胞生长表现出抑制作用;PM2.5水溶性组分各染毒浓度组始终没有对细胞生长表现出抑制作用,仅个别染毒浓度组在48h时对细胞生长表现出促进作用;PM2.5脂溶性组分最低染毒浓度组(10μg/mL)始终没有表现出对细胞生长的抑制作用,较低浓度染毒组(100μg/mL)在6h时即表现出对细胞生长的抑制作用,随着时间的延长,至染毒时间为72h时对细胞生长的抑制作用消失,高浓度染毒组(200, 400μg/mL)对细胞生长始终表现出抑制作用,且随着时间的延长,高浓度染毒组细胞活力跟溶剂对照组相比差距越来越大.

2.1.2 不同浓度PM2.5各样本对A549细胞死亡率的影响 如表1所示,对于PM2.5单纯颗粒物,除染毒10h外,其他时间点其对应的细胞存活率都显著低于相同条件下的PM2.5完全颗粒物;对于PM2.5水溶性组分,在各个时间点其对应的细胞存活率都显著高于相同条件下的PM2.5完全颗粒物;对于PM2.5脂溶性组分,其高浓度染毒组(200, 400μg/mL)对应的细胞存活率始终显著低于相同条件下的PM2.5完全颗粒物,而其他染毒浓度组对应的细胞存活率则表现为不小于相同条件下的PM2.5完全颗粒物.

表1 PM2.5完全颗粒物、单纯颗粒物、水溶性组分、脂溶性组分对A549细胞染毒后细胞存活率Table 1 The effects of original PM2.5, pure particles, water-soluble, fat-soluble on cell survival

注:细胞染毒后与同一染毒时间的PM2.5完全颗粒物染毒组相比,*为<0.05,**<0.01.

2.2 不同浓度PM2.5各样本染毒24h后对A549细胞炎性因子IL-6和TNF-α分泌量和表达的影响

2.2.1 不同浓度PM2.5各样本染毒24h后对A549细胞IL-6分泌量的影响 不同浓度PM2.5各染毒样本对A549细胞染毒后细胞培养上清中IL-6分泌量如图2所示,在染毒浓度为100μg/mL及以上时,PM2.5完全颗粒物染毒后细胞培养上清中IL-6分泌量显著高于溶剂对照组,染毒浓度在50μg/mL及以上时,PM2.5单纯颗粒物和PM2.5脂溶性组分染毒组细胞培养上清中IL-6分泌量显著高于溶剂对照组,但PM2.5水溶性组分各染毒浓度对应细胞培养上清中IL-6分泌量相比于溶剂对照组差异始终不显著.

如图2所示,PM2.5单纯颗粒物染毒后上清IL-6含量与同浓度的PM2.5完全颗粒物相比差异不显著;PM2.5水溶性组分染毒后上清中IL-6含量与同浓度PM2.5完全颗粒物相比差异显著,在100μg/mL及以上浓度染毒时上清中IL-6含量显著低于同浓度PM2.5完全颗粒物;PM2.5脂溶性组分在100μg/mL染毒浓度时上清中IL-6含量显著低于同浓度PM2.5完全颗粒物,其余浓度染毒时上清中IL-6含量与同浓度PM2.5完全颗粒物相比差异不显著.

2.2.2 不同浓度PM2.5各样本染毒24h后对A549细胞TNF-α分泌量的影响 用PM2.5各染毒样本对A549细胞染毒后,各溶剂对照组及各不同处理组的细胞培养上清中能检测到TNF-α的含量几乎为零.

2.2.3 PM2.5各样本染毒24h后对A549细胞IL-6mRNA相对表达量的影响 以GAPDH为内参,用相对荧光定量PCR法测定的各染毒样本染毒后细胞IL-6mRNA相对表达量如图3所示,除PM2.5水溶性组分和PM2.5脂溶性组分外,其余染毒样本在50μg/mL及以上染毒浓度时都显著增加了A549细胞IL-6mRNA的相对表达量,其中PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物高浓度染毒时IL-6mRNA的表达量可达溶剂对照组的50倍以上.

图3显示,PM2.5单纯颗粒物在50μg/mL及以上染毒浓度时其对应细胞IL-6mRNA相对表达量显著高于同浓度的PM2.5完全颗粒物;而PM2.5水溶性组分和PM2.5脂溶性组分在染毒浓度为50μg/mL及以上时其IL-6mRNA相对表达量显著低于同浓度组的PM2.5完全颗粒物.

2.2.4 PM2.5各样本染毒24h后对A549细胞TNF-α mRNA相对表达量的影响 以GAPDH为内参,用相对荧光定量PCR法测定的各处理组TNF-α mRNA相对表达量如图4所示,除PM2.5脂溶性组分外,其余样本染毒组TNF-α mRNA相对表达量都显著高于溶剂对照组,而PM2.5脂溶性组分各染毒浓度TNF-α mRNA相对表达量显著低于溶剂对照组.

图4显示,PM2.5单纯颗粒物染毒后在10μg/mL及以上染毒浓度时TNF-α mRNA相对表达量显著高于同浓度的PM2.5完全颗粒物; PM2.5水溶性组分在染毒浓度为10μg/mL时其TNF-α mRNA相对表达量显著高于同浓度PM2.5完全颗粒物,在染毒浓度为100μg/mL及以上时TNF-α mRNA相对表达量显著低于同浓度的PM2.5完全颗粒物;PM2.5脂溶性组分在染毒浓度为10μg/mL及以上时TNF-α mRNA相对表达量显著低于同浓度PM2.5完全颗粒物.

2.3 不同浓度PM2.5各样本染毒24h后对A549细胞DNA损伤的影响

不同浓度PM2.5各样本对A549细胞基因组DNA造成的氧化损伤情况如图5所示,相比于溶剂对照组,除PM2.5水溶性组分外,其余样本在染毒浓度为100μg/mL及以上时细胞基因组DNA碱基缺失增加显著.

此外,图5显示,PM2.5水溶性组分在染毒浓度为100μg/mL及以上时其造成的DNA损伤程度显著低于同浓度PM2.5完全颗粒物,PM2.5脂溶性组分在染毒浓度为100μg/mL时其造成的DNA损伤程度显著低于同浓度PM2.5完全颗粒物,PM2.5单纯颗粒物与PM2.5完全颗粒物相比造成的DNA损伤程度差异不显著.

3 讨论

PM2.5成分复杂,其主要由可溶性盐、金属元素、有机物质、碳质成分和生物组分等组成[24-25].根据PM2.5各组分样品的制备过程及前期研究结果易知PM2.5水溶性组分主要为PM2.5完全颗粒物中的可溶性盐、可溶性金属离子等成分,PM2.5脂溶性组分主要为其中的有机物质,PM2.5单纯颗粒物主要为其中的碳质组分.本研究制备了PM2.5完全颗粒物、PM2.5水溶性组分、PM2.5脂溶性组分和PM2.5单纯颗粒物,并从细胞活力、炎性损伤和DNA损伤3个方面对比研究了各不同组分样本对肺上皮细胞的影响,以探究PM2.5颗粒物不同成分可能对细胞造成的毒性作用.为便于与其他科研工作者的研究结果比较及结合MTS测定结果(从图1可以看出,染毒48h及以后细胞增长速度已经较慢,24h时细胞增长速度较快,生长状况较好),本研究中除MTS外,其余实验皆染毒24h.本研究中,除PM2.5水溶性组分外,其余组分高浓度(200, 400μg/mL)染毒时都在较短时间(6h)内即对肺上皮细胞生长表现出毒性作用,而低浓度(10, 50μg/mL)染毒组在较短时间时对细胞生长可表现出毒性作用,随着染毒时间的延长,其毒性作用逐渐减弱或消失;但随着染毒时间的延长,高浓度染毒组对应的细胞活力跟溶剂对照组相比差距越来越大.另外,从存活率的结果来看,PM2.5脂溶性组分和PM2.5单纯颗粒物在高浓度染毒时其对应细胞的存活率显著低于PM2.5完全颗粒物,而PM2.5水溶性组分对应的细胞存活始终显著高于PM2.5完全颗粒物.目前关于PM2.5不同组分样本在不同时间点对细胞活力影响的研究还比较少,本研究结果显示,除PM2.5水溶性组分外,其余PM2.5各样本低剂量时对细胞在短时间内产生毒性作用,高剂量时则具有时间反应关系,这可能由于低剂量染毒时颗粒物对细胞影响不是很大,虽然刚开始时可以表现出抑制细胞生长的作用,但随着染毒时间的延长细胞逐渐分解掉部分影响细胞活力的物质或逐渐适应不太恶劣的生长环境,而高剂量染毒组始终给细胞造成了一种极为恶劣的生长环境,因而细胞活力相比于溶剂对照组越来越弱.

IL-6和TNF-α是两种重要的炎性相关细胞因子,TNF-α作为前炎症因子,在炎症起始阶段起着重要作用[26],其作用于肺上皮细胞、内皮细胞或成纤维母细胞后可促使后者分泌粘附分子和IL-6、IL8等细胞因子[27],IL-6一方面可表现趋化作用,趋化免疫细胞从而调节炎症反应;另一方面也可以作为一种抗炎因子,调节颗粒物暴露后引起的肺部炎症及纤维化过程[28].有研究认为IL-6可以通过抑制TNF-α、IL-1等促炎因子产生,进而抑制炎症反应无限扩大[29-30].本研究用ELISA法和RT-QPCR法分别检测了染毒后细胞培养上清中IL-6和TNF-α的蛋白含量和染毒后胞内IL-6和TNF-α mRNA的表达量.ELISA检测结果显示除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本较高染毒浓度(100μg/mL及以上)显著增加了细胞培养上清中IL-6的分泌量,从100μg/mL染毒组的对比结果来看,PM2.5完全颗粒物和PM2.5单纯颗粒物升高细胞培养上清中IL-6分泌量的作用可能强于PM2.5脂溶性组分;各染毒样本对细胞染毒后并未在细胞培养上清中检测到TNF-α的存在,可能是上清中TNF-α浓度低于试剂盒检测下限所致.在RT-QPCR检测结果中,结合IL-6分泌情况推测IL-6mRNA测定结果可能是因为在染毒24h时PM2.5脂溶性组分染毒组对应的细胞IL-6mRNA表达量已经开始下降;TNF-α mRNA检测结果显示,除PM2.5脂溶性组分外,其余染毒样本都显著升高了细胞内TNF-α mRNA相对表达量.此前已有国内外研究人员[19,23,31]研究证实PM2.5完全颗粒物可以显著升高细胞培养上清中IL-6浓度和/或胞内IL-6mRNA表达量,该研究与之基本相一致;此前亦有研究人员[23,31-32]证实PM2.5完全颗粒物可以显著升高细胞培养上清中TNF-α浓度和/或胞内TNF-α mRNA表达量,本研究中包括PM2.5完全颗粒物在内某些样本染毒后胞内TNF-α mRNA相对表达量确有显著升高,与前人研究结果相一致,但各样本染毒后并未在细胞培养上清中检测到TNF-α的存在,在进行RT-QPCR反应时,相同模板TNF-α mRNA对应的Ct值均不同程度大于IL-6mRNA对应的Ct值,因而胞内TNF-α的mRNA表达量必然低于IL-6,此前有研究[19]表明粗颗粒物和细颗粒物对细胞染毒24h后上清中TNF-α分泌量都低于染毒后5h上清中分泌量,因此推测该研究中未在上清中检测到-α可能由于24h时细胞分泌到胞外的TNF-α量已经较少及高浓度染毒时细胞死亡较多所致.从炎性因子和上述MTS测定结果来看,PM2.5单纯颗粒物可能比PM2.5完全颗粒物有着更强的抑制细胞生长和促进炎性因子表达的作用,本研究中各样本间的比较皆是在同质量浓度下的比较,同质量的PM2.5单纯颗粒物相比于PM2.5完全颗粒物有着更多数量的碳核心颗粒,因而推测在抑制细胞活力和促进细胞产生炎症反应方面跟细胞接触到的碳核心颗粒数量可能起着很大作用.

PM2.5可导致细胞内活性氧(ROS)的增加[33-34], DNA的氧化损伤与ROS氧化作用密切相关,氧化应激诱导的DNA损伤是城市颗粒物空气污染的重要作用[35-36],DNA氧化损伤可以作为氧化应激及相关疾病的生物标志物[35],而且自由基相关的DNA和蛋白损伤被认为在癌症、动脉粥样硬化、关节炎和神经紊乱等年龄相关的疾病发展中起着重要作用[37].DNA氧化损伤后会产生链断裂、各种糖修饰及单个无碱基位点(AP位点)等,其中AP位点是由ROS产生的DNA损伤的主要类型之一[38-39],该研究通过利用醛反应性探针特异性地与AP位点的开环上醛基反应,对各染毒样本造成A549细胞DNA氧化损伤后形成的AP位点数进行了定量检测,本研究提示PM2.5水溶性组分并没有造成DNA碱基缺失的显著增加,其较高染毒浓度(100μg/mL及以上)所造成的DNA碱基缺失程度弱于PM2.5完全颗粒物.

4 结论

4.1 除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本都对A549细胞活力影响较大,且在高浓度染毒时始终对细胞生长表现出抑制作用,而低浓度染毒时则在较短时间对细胞生长表现出抑制作用,在较长染毒时间时抑制作用逐渐消失.

4.2 除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本对应的A549细胞IL-6mRNA的相对表达量和/或IL-6蛋白的分泌都显著升高,其中促进IL- 6mRNA相对表达量升高的作用依次为:PM2.5单纯颗粒物>PM2.5完全颗粒物>PM2.5脂溶性组分;除PM2.5脂溶性组分外,其余染毒样本都显著升高了TNF-α mRNA的相对表达量,其中促进TNF-α mRNA相对表达量升高的作用依次为: PM2.5单纯颗粒物>PM2.5完全颗粒物>PM2.5水溶性组分.

4.3 除PM2.5水溶性组分外,其余染毒样本都显著增加了A549细胞DNA碱基缺失,并且在此方面,PM2.5完全颗粒物、PM2.5单纯颗粒物和PM2.5脂溶性组分差异很小.

4.4 总体上来看,PM2.5水溶性组分在抑制细胞活力、造成细胞炎性损伤及DNA损伤方面作用相对较小;PM2.5脂溶性组分与PM2.5完全颗粒物表现出的毒性作用几乎一致.PM2.5单纯颗粒物比PM2.5完全颗粒物可能有更大的毒性作用,可见作为载体的固体核心颗粒(PM2.5单纯颗粒物)在对机体产生毒性作用时也起着相当大的作用.

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(4)从表4可知，不论是对甲基蓝溶液还是对甲基橙溶液，吸附百分率的值由大到小顺序为：复合材料>硅胶>硅酸钙>硅酸镁。

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致谢：感谢环境科学研究院高健博士在PM2.5颗粒物采集中提供的帮助.

* 责任作者, 温占波, 助理研究员, wenzhanbo@yeah.net;李劲松, 研究员, lij-s@163.com

Toxicological study at inflammatory factors and DNA damages effects of Beijing atmospheric PM2.5and its different fractions to pulmonary epithelial cells A549 of human

JIAO Zhou-guang1, FU Xu-lei2, WEN Zhan-bo1*, LI Jin-song1*, LI Na1, ZHANG Ke1, WANG Jie1, HU Ling-fei1

(1.State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China；2.College of Food Science and Technology, Bohai University, Jinzhou 121013, China)., 2016,36(5)：1579~1588

In order to investigate the toxicity effect of atmospheric PM2.5and its different fractions to human pulmonary epithelial cells A549 with respect to the relationship between PM2.5dosage and cell response, the water-soluble, fat-soluble, pure particle fractions of PM2.5(designated WSP2.5, FSP2.5and PPP2.5, respectively) prepared from original PM2.5samples (designated OP2.5) and OP2.5were to treat A549 cells at different PM concentrations (10, 50, 100, 200, 400μg/mL, respectively). The MTS method was used to test the cell viability at 6h, 10h, 24h, 48h and 72h post-treatment, while ELISA and RT-QPCR were employed to detect the production of inflammatory cytokines IL-6 and TNF-α and the AP-sites counting was conducted to determine the level of intracellular DNA damage at 24h post-treatment. WSP2.5had very limited effect to inhibit cell growth and induce inflammatory damages and DNA base deletion. FSP2.5, PPP2.5and OP2.5at high concentrations showed the inhibitory effect to cell growth across treatment; when cells were treated with low concentrations of FSP2.5, PPP2.5or OP2.5, the inhibition of cell growth occurred within a short period and then disappeared over time. FSP2.5, PPP2.5andOP2.5treatment significantly induced the production of IL-6at both mRNA and protein levels, while WSP2.5, PPP2.5andOP2.5treatment significantly induced the mRNA expression of TNF-α. FSP2.5, PPP2.5and OP2.5treatment also induced the considerable DNA base deletion. In a word, not only the complex components adsorbed on the solid core granules of PM2.5, but also the solid core granules themselves contributed to the cytotoxicity effects.

PM2.5；fractions；A549 cells；cell viability；inflammatory cytokines；DNA damage

X503.1

A

1000-6923(2016)05-1579-10

焦周光(1990-),男,河北邯郸人,硕士研究生,主要从事生物气溶胶与健康,大气颗粒物相关毒理学研究.

2015-10-18

国家自然科学基金课题(41205102)