酱香大曲中可培养的冠突散囊菌的初步研究

徐佳，邱树毅，周鸿翔，班世栋，王晓丹，*

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

酱香大曲中可培养的冠突散囊菌的初步研究

徐佳1，2，邱树毅1，2，周鸿翔1，2，班世栋3，王晓丹1，2，3*

（1.贵州大学贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州贵阳550025；3.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

采用平板涂布法从酱香大曲中分离筛选霉菌，结合形态观察和真菌16S rDNA-ITS基因序列同源性比对分析，对筛选到的菌株进行鉴定。根据大曲功能和散囊菌特点，测定该菌酶活力；采用固相微萃取-气质联用技术对固态发酵的挥发性香味物质进行分析。筛选分离得到一株散囊菌，归类并命名为冠突散囊菌（Eurotium cristatus），该菌的酸性蛋白酶、脂肪酶、果胶酶酶活力较高，分别为594.62 U/g，45.29 U/g和410.26 U/g；固态发酵物具有花香和果菜香，挥发性香味物质以高级醇、酮和呋喃类为主体，其中L-芳樟醇、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-戊基呋喃是主要的呈香物质。分离得到的冠突散囊菌的产酶特点和产香功能反映了霉菌在酱香型大曲中的重要作用。

酱香大曲；冠突散囊菌；酶活；香气成分

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）又名冠突曲霉，为子囊菌门不整囊菌纲散囊菌目散囊菌科散囊菌属的真菌，是曲霉属霉菌小冠曲霉的有性型名称［1］，主要存在于中国传统发酵茶茯砖茶中，土壤、冬虫夏草、中药材和木屑也有分布。该菌与同属内其他种的区别是在查氏琼脂上可正常生长，子囊孢子具冠状突起及粗糙具尖疣的表面，但由于该菌子囊孢子的形态特征不是很稳定［2］，所以冠突散囊菌种名的鉴定一直存在争议。目前中国传统白酒酿造微生态中，张良等［3］曾在研究浓香型白酒泸州老窖古酿酒作坊空气中微生物时有发现冠突散囊菌，其研究表明，作坊空气中冠突散囊菌在数量上最多，对其产酶进行了试验，证明该菌脂肪酶活性较高。而在茯砖茶的研究中，冠突散囊菌具有良好的产酶能力，能分泌多酚氧化酶［55］、果胶酶、纤维素酶［4］、脂肪酶、淀粉酶［5］、蛋白酶［5-6］等胞外酶，对原材料进行降解，同时还能生成冠突散囊菌特有的“菌花香”［7］。虞飞［8］还在以冠突散囊为优势菌的茯砖茶中检测到大量吡嗪类酱味物质。

酱香大曲具有糖化和生香的作用，微生物是制曲过程中糖化发酵的动力，也是大曲酱香的来源［9］。微生物能分泌多种水解酶进而分解原料得到可发酵性糖和一些氨基酸，在制曲过程中还能生成一些酱香物质，从而达到大曲的生香作用［10］。霉菌是组成大曲微生物的主要菌群之一，目前从酱香大曲分离到的霉菌种类较多，能分泌活性较高的糖化酶、蛋白酶等多种酶，也是实现糖化发酵的关键微生物［11］，可以促进大曲的成熟；同时能生成酸、醇、酯等风味物质［9］，对大曲的香味有积极贡献。本实验从酱香大曲中分离霉菌，经过研究其形态，并结合大曲的功能来探讨分离霉菌的特性，为研究大曲霉菌在酿造中发挥的作用提供更多的参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1大曲

酱香型大曲来自贵州某酒厂储存6个月粉碎后的酿酒车间生产用曲。

1.1.2主要试剂

植物基因组DNA提取试剂盒：天根生化科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、NaCl、K2HPO4、KCl、琼脂：成都金山化学试剂有限公司；NaNO3、MgSO4·7H2O：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、查氏培养基（Czapek agar medium，CAM）、马铃薯葡萄糖液体培养基：均购于上海博威科技有限公司。

20%蔗糖查氏琼脂培养基［2］：蔗糖20 g，NaNO30.2 g，K2HPO40.1g，KCl0.05g，MgSO4·7H2O0.05g，FeSO40.001g，琼脂2 g，溶于100 mL水，121℃灭菌20 min。

麸皮培养基［12］：麸皮15 g，加入15 mL水，搅拌均匀，121℃灭菌20 min。

高粱小麦固体发酵培养基［13］：高粱与小麦各15 g，加入10 mL水，搅拌均匀，121℃灭菌20 min。

1.2仪器与设备

S-3400N扫描电镜：日本HITACHI（日立）公司；UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津公司；手动固相微萃取装置：美国Supelco公司；6890A气相色谱-5975C质谱联用仪：美国安捷伦公司。

1.3试验方法

1.3.1霉菌的分离纯化

称取10 g大曲加入含有玻璃珠的90 mL无菌生理盐水中，充分振荡30 min，取原液1 mL梯度稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，进行平板涂布，然后放入32℃霉菌培养箱中培养3 d，挑取单个菌落进行纯化，多次划线分离镜检无杂菌后即为纯化菌种，将纯化菌种转接斜面保存，并编号。

1.3.2霉菌的的鉴定

（1）菌株FBKL3.0002的形态学鉴定

将已纯化的FBKL3.0002菌株分别接种到CAM和20%蔗糖查氏琼脂培养基上，25℃培养20 d左右，观察菌落的形态特征，挑取少量菌体做前处理后，制片在S-3400N扫描电镜下观察菌丝及其孢子形态特征，通过《中国真菌志》［2］及相关文献［1］对其进行形态学鉴定。

（2）霉菌的分子生物学鉴定

将分离纯化的霉菌接种到马铃薯液体培养基中，30℃条件下在摇床中培养5～7 d，然后收集菌丝球，测序由上海生工生物工程有限公司完成，用植物DNA基因组试剂盒提取DNA。聚合酶链反应（polyuerase chain reaction，PCR）扩增采用真菌内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列通用引物ITS4（5'TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC3'）和ITS5（5'GGAA GTAA AAGT CGTA ACAAGG3'），并将测序结果在NCBI数据库中进行比对。

1.3.3冠突散囊菌粗酶液的制备

将冠突散囊菌接种到PDA斜面上30℃培养7 d，用无菌水洗下孢子，之后以10%的接种量接种到麸皮培养基中30℃培养3 d，所得培养物与水混合（1∶10，g∶mL）搅匀，40℃水浴1 h，每隔15 min搅拌一次，过滤，所得滤液为粗酶液。

1.3.4冠突散囊菌的酶活测定

糖化型淀粉酶活力测定：采用3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法［14］；酸性蛋白酶活力测定：采用国标GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》［15］；脂肪酶活力测定：采用国标GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》［16］；纤维素酶活力测定：参照文献［17］；果胶酶活力测定：采用轻工行业标准QB 1502—1992《果胶酶制剂》［18］。

1.3.5冠突散囊菌固体发酵产物的香气成分测定

取培养7 d的冠突散囊菌斜面试管一支，用10 mL的无菌水洗下，然后以10%的接种量接入高粱与小麦固体发酵培养基中，30℃培养7～9 d。均匀取样品约10 g，置于50 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入手动进样器，在温度120℃左右顶空萃取40 min后取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口，热解吸3 min进样。

色谱柱：ZB-5弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm× 0.2 μm），柱温40℃（保留2 min），以5℃/min升温至270℃，运行时间：48 min；汽化室温度：250℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压52.54 kPa，载气流速1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1 min。

气相色谱条件：电子电离（elctronic ionization，EI）源，离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 294 V；接口温度280℃；质量范围20～450 amu。

2　结果与分析

2.1霉菌的分离筛选及鉴定结果与分析

采用常规的平板涂布分离方法，根据霉菌在培养基上生长具有的不同形态特征，从酱香型白酒大曲中共分离纯化得到9株霉菌。通过对16S rDNA-ITS区域测序并在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）比对鉴定，可将所得9株菌划分为7属，即2株为犁头霉属霉菌、1株毛霉属霉菌、1株曲霉属霉菌、1株青霉属霉菌、1株拟青霉属霉菌、1株红曲霉属霉菌、2株散囊菌属霉菌，其中除散囊菌属霉菌，其它属霉菌在各种酱香型白酒大曲中均有存在，是酱香大曲制曲过程中的优势菌，也是本实验大曲的重要霉菌类群。实验还分离到散囊菌属霉菌，其中1株散囊菌已保藏于贵州大学发酵重点实验室，并编号：FBKL3.0002。该菌在酱香酒酿造微生态中分离报道的较少，对其研究的很少，因此本课题将对该菌进行全面的鉴定，并结合大曲的功能，对该菌在酿造过程中的特性做进一步研究。

2.1.1菌株FBKL3.0002的形态学特征

通过平板划线分离纯化，按照《中国真菌志》的形态观察培养方法，将得到的FBKL3.0002菌株接种在CAM和20%蔗糖查氏琼脂培养基上观察其菌落形态，并收集少量菌体进行电镜扫描，其结果如图1所示。

图1　菌株FBKL3.0002在CAM培养基的形态（A）、分生孢梗茎（B）、分生孢子头（C）、闭囊壳（D）、子囊孢子（E）及分生孢子（F）的扫描电镜图Fig.1 SEM of colony morphology（A），conidiophore stem（B），conidiophore head（C），cleistothecium（D），ascospores（E）；conidium（F）of strain FBKL3.0002 on CAM medium

由图1A可知，观察到该菌在CAM培养基上生长缓慢，25℃10～12 d直径20 mm；周边黄色，近于橄榄浅黄色，内部颜色较深，近于橄榄褐至丁香褐色，老后变成褐色；可见大量黄色闭囊壳产生，分生孢子结构不明显。菌落在20%蔗糖查氏琼脂上生长较快，特征与在CAM上者相同。分生孢梗茎直立、光滑，如图1-B所示；分生孢子头幼时球形，老后呈疏松放射形，直径可达140 μm，少数呈疏松短柱形，产孢结构单层，如图1-C所示；闭囊壳球形或近球形，黄色，直径（100～200）μm，成熟较快，如图1-D所示；子囊孢子双凸镜形，具两个明显的纵向鸡冠状突起，宽约（0.8～1.0）μm，孢子体（5～6）μm×（4～5）μm，凸面不平粗糙，具尖疣，如图1-E所示。分生孢子椭圆形，少数近球形，（4.0～4.8）μm×（3.2～4.0）μm，壁粗糙，具小刺，如图1-F所示。将该菌初步鉴定为冠突散囊菌（Eurotium cristatus）。

2.1.2菌株FBKL3.0002的分子生物学鉴定

将送至上海生工得到的菌株FBKL3.0002的ITS区域测序结果在NCBI数据库中进行Nucleotide blast比对，并构建系统发育树。菌株FBKL3.0002的ITS片段为520 bp，与数据库中的Eurotium cristatum（Sequence ID：KM388844）相似度达到100%。菌株的系统发育树见图2，由图2可知，菌株FBKL3.0002与Eurotium cristatum处于同一分支，进一步鉴定为冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。

图2　菌株FBKL3.0002系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain FBKL3.0002

2.2菌株FBKL3.0002的产酶活性

表1　冠突散囊菌5种酶活力测定结果Table 1 Determination results of five enzymes activity of Eurotium cristatum

根据酱香大曲的酶活体系及霉菌在酿造过程中具有的5种代表性酶对该菌的产酶特性进行了研究，其产酶活力如表1所示。由表1可知，在所测定的5种酶中，其均表现出一定的活性，表明该菌在大曲中具有产酶能力，对大曲的酶活体系具有贡献作用。如表1所示，各种酶的酶活力差异较大，酸性蛋白酶、果胶酶、脂肪酶有较高活性，其他酶总体表现得相对较低。其中酸性蛋白酶活力最高，达到594.62 U/g，这与在酿酒的酸性环境中霉菌以主产酸性蛋白酶相符合；果胶酶活力为410.26 U/g，有助于降低原料的黏度，并与纤维素酶协同作用，提高原料中淀粉的利用率；脂肪酶活力为45.29 U/g，活性较高，这与在首次从浓香型白酒空气中发现冠突散囊菌时研究其产酶试验结果相似，这对霉菌生成香味物质具有重要贡献；而其他酶相对活力表现一般，但对大曲酶系还是具有积极贡献。

2.3冠突散囊菌固态发酵物香气成分

冠突散囊菌进行了模拟发酵实验，通过固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术，对其发酵产物的挥发性香味成分进行了测定。挥发性成分总离子流色谱图见图3，部分化合物的香味成分及含量见表2。

图3　冠突散囊菌固体发酵物挥发性香味成分总离子流色谱图Fig.3 Total ions chromatogram of the aromatic compounds of Eurotium cristatumsolid-state fermentation

表2　冠突散囊菌挥发性成分中呈香物质及相对含量Table 2 Aromatic compounds and relative content of Eurotium cristatumsolid-state fermentation

结果表明，该菌发酵产物共检测出36种化合物，鉴定出26种化合物，有10种化合物未知，鉴定出的16种已知化合物见表2。由表2可知，呈香物质在种类上大概可分为醛类、醇类、酮类、呋喃、烯烃类物质，发酵产物中以醇、酮和呋喃类物质为主，其种类和相对含量最多，也是主要的呈香物质。

在鉴定的26种化合物中有16种物质具有香味，占总挥发性成分的77.50%，它们主要是醇、酮和呋喃类物质，可以提供多种香味，以花香与果菜香为主体香。醇类是主要的呈花香化合物，其中L-芳樟醇相对含量最高，达到28.32%，该物质属于具有浓烈花香味的天然香料物质，香气柔和，轻扬透发，不甚持久，是重要的花香味物质；而1-辛烯-3-醇具有蘑菇香味，它存在于日本松蕈和蘑菇中，是蘑菇散发出来的重要香味物质，其相对含量可达13.18%。呋喃类和酮类化合物是主要的呈水果香物质，2-戊基呋喃具有果香与甜香，相对含量最高为6.75%，2-正丙基呋喃也具有果香；二甲基丁酮具有香蕉味，2-壬酮除具有果香，还含有油脂香，它们相对含量分别为3.22%与1.54%。该菌除了能提供花香和果菜香外，还能提供一些其他香，如2-丁醇、2-甲基呋喃具有巧克力香，二甲基丁醛、己醛、芳樟醇氧化物具有轻淡的青草香，3-辛酮还具有树脂香，相对含量可达10.86%。由以上结果可以看出，该菌具有产花香和果菜香的能力，醇、酮和呋喃类是其主要的呈香载体物质，这对形成具有多种风味物质的酱香酒可产生一定的贡献，可作为重要的产香功能菌。

3　结论

采用传统微生物培养方法，从酱香大曲分离到1株散囊菌属霉菌FBKL3.0002。通过形态鉴定和分子生物学相结合的方法对该菌进行了鉴定，其鉴定结果为冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。

实验对冠突散囊菌的糖化型淀粉酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、果胶酶活力进行了测定，各种酶活分别为288.13 U/g、594.62 U/g，45.29 U/g、3.29 U/g和410.26 U/g，其中酸性蛋白酶、果胶酶、脂肪酶有较高活性，其他酶总体表现得相对较低，但各种酶对大曲酶系还是具有积极贡献。

实验采用固相微萃取-气质联用技术对冠突散囊菌固态发酵物的挥发性香味物质进行分析，该菌具有产香能力，其中以产花香和水果香为主，醇、酮和呋喃类是主要的呈香物质，对酱香型白酒的风味物质形成有贡献。

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XU Jia1，2，QIU Shuyi1，2，ZHOU Hongxiang1，2，BAN Shidong3，WANG Xiaodan1，2，3*
（1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy，Guiyang 550025，China；2.School of Liquor-making and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China；3.College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Molds were screened from Moutai flavor Daqu，and then identified by dilution plate coating method，combining with morphology observation and fungal 16SrDNA-ITS gene sequence homology comparison analysis.According to the function of Daqu and the characteristics ofEurotium sp.，the enzyme activity of the strain was determined.Using SPME-MS technique，the volatile substances of the solid-state fermentation were analyzed.The results showed that aEurotium cristatuswas screened，and the enzyme activity of its acid protease，lipase，pectinase were 594.62 U/g，45.29 U/g and 410.26 U/g，respectively.The substances of solid-state fermentation of the strain has floral and fruity flavor，and the main volatile flavoring substances were mainly higher alcohols，ketones，and furan.L-linalool，1-octene-3-alcohol，3-symplectic ketones and 2-amyl furan were the dominating aroma-producing substance.The enzyme production characteristics and aroma production function of the isolatedE.cristatusreflected the important role of mold in Moutai-flavor Daqu.

Moutai-flavor Daqu；Eurotium cristatus；enzyme activity；aroma components

TS201.3

0254-5071（2016）06-0055-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.012

2016-02-16

贵州省工业攻关项目（黔科合GZ字［2014］3012）；贵州省重大专项项目（黔科合重大专项字［2013］6009号）；贵州省省校合作计划项目（黔科合LH字［2014］7672）

徐佳（1989-），男，硕士研究生，研究方向为应用生物技术。

王晓丹（1980-），实验师，博士研究生，研究方向为应用生物技术。