红提葡萄酒发酵酵母菌的分离及耐受性研究

贾春凤，贾志军，朱维红，张筱梅*

（1.河北保定学院生化系，河北保定071000；2.河北大学工商学院，河北保定071000）

红提葡萄酒发酵酵母菌的分离及耐受性研究

贾春凤1，贾志军2，朱维红1，张筱梅1*

（1.河北保定学院生化系，河北保定071000；2.河北大学工商学院，河北保定071000）

该实验从红提葡萄发酵过程中分离出酵母菌株，并对其耐受性进行研究，旨在提高红提葡萄酒酿造品质。通过培养不同发酵时期菌株，并用肉眼和显微镜分别观察其菌落和细胞形态，再测定其发酵能力、耐糖性、耐酸性、耐酒精度。结果表明，共分离出酵母菌140株，经菌落形状和细胞形态鉴定后，获得典型的三类共6株酵母菌；在发酵过程中，加入分离菌株比自然发酵可多发酵1.6%葡萄糖，多产生0.78%CO2和0.82%vol的酒精，且发酵趋势和安琪酵母、自然发酵过程一致；以安琪酵母为对照，对6株菌进行耐糖性、耐酸性、耐酒精度试验，得出综合耐受性较好的酵母菌株为A3、B7和C1。

红提葡萄；酵母菌；分离；耐受性

红提葡萄系欧亚种，自1986年引入我国以来，红提葡萄的生产得到了迅猛发展，产量逐年提高［1］。红提个大、色艳、味甜［2］，且营养十分丰富，含有17%以上的葡萄糖和果糖，0.5%～1.5%的苹果酸、酒石酸、柠檬酸等，0.15%～0.90%的蛋白质和丰富的钾、钙、钠、锰等人体必需的微量元素，含有多种维生素、果酸、氨基酸和矿物质，比较适合酿酒［3］。随着人们生活水平的提高，利用红提、巨峰、马奶等常见葡萄品种自酿葡萄酒倍受人们欢迎［4］。酵母菌在葡萄酒酿造过程中起着重要作用，不同品种葡萄自身所带酵母菌发酵菌株不同，不同发酵菌株发酵产物不同［5-8］，优良的葡萄酿酒酵母能使发酵过程易于控制，使葡萄浆果的优良品质在葡萄酒中得以最大限度的表达，使葡萄酒香气协调、细腻、优雅，风格特征突出。研究发现，国内酿酒酵母品种较少，因此，酿酒爱好者家庭自酿葡萄酒过程中污染现象严重，且专门用于红提葡萄酒发酵的菌种更是鲜有报道［9-11］。

本研究以红提葡萄为原料，分离发酵过程中不同时期的酵母菌，力求能够分离出高性能酵母菌株，既可丰富国内酿酒酵母种类，也可为将来自酿红提葡萄酒提供特定菌种，避免自酿过程中的污染，提高家庭自酿葡萄酒的品质。因此，本研究主要以安琪酵母为对照菌株，从红提葡萄酒自然发过程中分离不同发酵时期的酵母菌；对分离酵母菌进行菌落形态和细胞形态观察，对分离菌株进行分类；对选定菌株的发酵能力进行测定采用可见分光光度计法对已选定菌株的耐糖性、耐酸性、耐酒精度进行研究。力争得到能够促进红提葡萄酒发酵，且适应能力较强的酵母菌株，为自酿较高质量红提葡萄酒打下基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1原材料

红提葡萄：购于河北省保定市市场；安琪葡萄酒酿造专用酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2化学试剂

琼脂粉（生化试剂）：天津市大茂化学试剂厂；葡萄糖、酵母浸粉（生化试剂）、蛋白胨（生化试剂）、氯霉素、HCl、NaOH、无水乙醇（均为分析纯）：天津市北方天医化学试剂厂。

1.1.3培养基［12］

酵母菌分离及保存采用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（yeast extract peptone dextrose，YEPD）：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂2%；溶于1 L蒸馏水中（可另加100 mg/L的氯霉素抑制细菌繁殖），115℃灭菌30 min。

耐高糖试验培养基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，不同含量葡萄糖（100 g、200 g、300 g、400 g、500 g），20 g琼脂，溶于1 L蒸馏水中，115℃灭菌30 min。

耐高酸试验培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏10 g，不同pH值（1、2、3、4、5、6）溶于1 L蒸馏水中，115℃灭菌30 min。

耐酒精试验培养基：葡萄糖20 g，酵母膏10 g，蛋白胨20 g，不同含量乙醇（0、6%、9%、12%、15%、18%）溶于1 L蒸馏水中，115℃灭菌30 min。

1.2仪器与设备

YY0027-90电势恒温培养箱：湖北省黄石市恒冯医疗器械有限公司；SW-CJ-2F超净工作台：苏净集团安泰公司；YXQGO2手提式电热压力消毒器：山东安得医疗科技有限公司；BX51 OLYMPUS荧光显微镜：奥林巴斯光学工业株式会社（日本）；JA2002电子天平：上海精天电子仪器仪器有限公司；0-50%手持糖度仪：上海天垒仪器仪表有限公司；HC.TP12A.2架盘药物天平：北京医用天平厂；722N可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DHS-3C酸度计：上海越平科学仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1葡萄酒加工工艺流程［13-14］

红提葡萄→去梗、清洗→浸泡、沥干→称质量、添加葡萄糖→捏碎、摇匀→加塞、密封→发酵→换瓶除去沉淀物→澄清→过滤→装瓶→贮藏

操作说明：将葡萄去梗后，清洗3遍，在水中浸泡30min，沥干；按照葡萄∶葡萄糖=8∶1的质量比添加葡萄糖；将葡萄捏碎至250 mL锥形瓶中，摇晃均匀；加塞，并用保鲜膜包扎密封。将锥形瓶放入已调整温度至28℃的恒温培养箱中进行发酵酿造，前3 d，每隔24 h，在超净台中打开密封，摇匀30 s；每天定时测定发酵液中的酵母菌种类和数量、发酵液中糖含量和酒精度，发酵液酒精度和糖含量基本不变后，停止发酵；发酵结束后，将发酵上清液倒入新瓶中，放入冰箱中冷藏24 h澄清；用6层医用纱布过滤，分装到洗净的棕色玻璃瓶中，贮藏到0～4℃冰箱中备用。

1.3.2葡萄酵母菌种的分离

每天分别取出样品0.5 mL，用生理盐水稀释样品、振荡。第一天稀释10-1、10-2、10-3，以后根据前天培养的平板中菌落个数合理调整稀释倍数，在选取的三个稀释度中分别取0.1 mL放入培养皿中，倒入酵母菌分离培养基，混菌培养，每个样品3个平行，分别进行标记，放入设定温度为28℃的恒温培养箱中培养36 h。随后，每天分别肉眼观察酵母菌菌落形态，挑取代表性菌落、划线分离，初步显微镜鉴定、记录不同种类酵母菌出现时的发酵时间，并试管斜面划线保存不同种类酵母菌，做好标记，备用。

1.3.3菌种的活化

将少量安琪葡萄酒酿造专用酵母颗粒溶于YEPD液体培养基的试管中，加塞，包扎。放置于设定温度为28℃的恒温培养箱中培养24 h，挑取培养液制斜面试管中划线、培养、保存备用。将待测分离菌株和斜面安琪酵母接种于YEPD斜面培养基上，28℃培养1～2 d，备用。

1.3.4菌悬液的制备

挑取1.3.3已活化菌株1环菌苔接入2 mL无菌水中，混匀成菌悬液，用可见分光光度计法，调整菌含量，使其相等，且OD600nm值在0.8左右，待用。

1.3.5分离酵母菌发酵力试验

称量葡萄160 g和葡萄糖20 g各9份，分别放到9个锥形瓶中。将分离、初步筛选出的6株酵母菌根据其在发酵过程中的出现时间，于相对应发酵时间时，加入以上活化菌种溶液1 mL，标号为1，共三个平行。同时在标号为2的三个样品中分别加入与1号样品相同浓度的活化的安琪酵母溶液1 mL作为对照。在3号三个样品中只需加入总量相同的培养液作为对照。将9个锥形瓶放入28℃的恒温培养箱中进行发酵。每天用手持测糖度仪测定发酵液中的糖含量，利用CO2失重法测定分离菌种的发酵速度，根据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》［15］中的密度瓶法测定酒精含量。至糖含量、CO2质量、酒精度基本不变为止。

1.3.6分离酵母菌浓度与其吸光度值关系

将活化后的安琪葡萄酒酿造专用酵母制成原菌液，将原菌液分别稀释，使其含量分别为20%、40%、60%、80%、100%，分别用可见分光光度计在波长600 nm处测定其OD600nm值。同时，将各个菌液稀释倒平板后菌落计数，测其菌含量。以菌液OD600nm值（x）为横坐标，以菌浓度（y）为纵坐标作图，考察二者关系。

1.3.7分离菌种耐受性试验

根据薛波等［16］提到的方法，参考刘向勇等［17-19］试验方法进行分离菌种耐糖性、耐酸性和耐酒精度测定。具体方法如下：将1.3.4中已制备好的菌悬液，按3%的接种量，分别接种到按1.1.3中方法，已配制好的不同糖含量的耐糖性试验培养基、不同pH值得耐酸试验培养基、不同酒精含量的耐酒精度试验培养基中，在28℃的恒温培养箱中培养24 h，用可见分光光度计法测定每个样品中的菌含量。

1.3.8分析检测

糖含量：采用手持糖度仪测定；菌体浓度：采用可见分光光度计法；pH值：采用酸度计测定；发酵速率：采用CO2失重法；酒精度：采用密度瓶法。

1.3.9数据处理

每组试验重复3次，用Excel处理数据，最后采用平均值表示。用Sigmaplot 10.0和Excel作图。

2　结果与分析

2.1酵母菌的初步分离

在红提葡萄酒自然发酵过程中，每天进行酵母菌分离，并经菌落形态和细胞形态的初步鉴定，到第8天～第10天时，分离得到菌株菌落形态和细胞形态与1～7 d中分离得到得基本相似，且7 d后，发酵液中的菌含量已经＜1× 103CFU/mL。因此在进行重复分离菌株、根据菌落形态和细胞形态分类时，只分析了1～7 d分离得到菌株，共140株菌。取前7 d分离所得酵母菌140株，进行菌落形态和细胞形态分析，发现7 d中，典型酵母菌株共3种形态。根据分离时间和形态的典型性，最后保存6株最具代表性菌株，如表1所示。

表1　自然发酵葡萄酒中分离出的代表菌株Table 1 Representative strains isolated from natural fermented wine

由表1可知，第一类菌种代表字母为A，保存代表菌株分别为第1天分离所得A1、第3天分离所得A3。第二类菌种代表字母为B，从第5天才开始出现，保存菌种分别为第5天分离所得B5、第7天分离所得B7。第三类菌种代表字母为C，保存菌种分别为第1天分离所得C1、第6天分离所得C6。

2.2分离酵母菌发酵力测定

分离出的菌株是否具能够促进红提葡萄酒的发酵，是考察菌株有没有价值的重要指标。根据方法1.3.5，取分离得到的6株菌菌悬液1 mL，按照各自分离对应时间（第1天、第3天、第5天、第6天、第7天）加入样品发酵液中；同一时间，在对照发酵液中加入相同量的安琪酵母，并和自然发酵过程做对比，测定6株分离菌的综合发酵糖能力。

2.2.1分离酵母菌发酵葡萄糖能力测定

由图1可知，在葡萄发酵的第1天，葡萄液的糖含量骤降2%～4%。第2天～第3天糖浓度下降较缓慢，第3～第8天糖浓度下降较快，可见三组葡萄发酵过程中糖度的变化大体是一致的。第9天～第10天加入分离酵母菌的样品和自然发酵对照样品糖浓度下降趋于平稳。到第10天时，加入分离酵母菌的样品中，共发酵葡萄糖18.1%；同期，自然发酵中，共发酵葡萄糖16.5%，可见分离酵母菌的加入比自然发酵可多发酵1.6%的糖，更有利于红提葡萄酒的酿造。

图1　发酵液中葡萄糖含量变化Fig.1 Changes of glucose concentration in the fermentation broth

2.2.2分离酵母菌发酵速率测定

由图2可知，三个样品发酵产生CO2的趋势相同。但比较分析发现，第1天～第8天，和安琪酵母、自然发酵比较，分离酵母菌发酵速度较快，到第9～第10天，自然发酵和分离酵母菌发酵产生的CO2已基本稳定，分离酵母菌可比自然发酵多产生0.78%CO2，但稍低于安琪酵母发酵。总体可以看出，分离菌株发酵速度较快。

图2　不同酵母菌发酵速率的比较Fig.2 Comparison of fermentation rate of different yeasts

2.2.3分离酵母菌发酵生产酒精能力测定

考察发酵1～10 d中三个样品中酒精含量的变化。由图3可知，三个样品发酵产生酒精的趋势相同，且与其发酵产生CO2结果相对应。在整个发酵过程中，分离酵母菌发酵产生酒精量都明显高于自然发酵，到第10天时，比其酒精含量高出0.82%vol，只稍低于安琪葡萄酒酿造专用酵母发酵产生的酒精度。因此，分离酵母菌发酵可产生较多酒精。

图3　不同样品中的酒精含量变化Fig.3 Changes of alcohol content in different samples

2.3分离酵母菌耐受性测定

2.3.1分离酵母菌浓度与其吸光度值关系

根据方法1.3.6，测得安琪葡萄酒酿造专用酵母原菌液含量分别为20%、40%、60%、80%、100%时，对应的菌浓度分别为0.332×107CFU/mL、0.734×107CFU/mL、0.982×107CFU/mL、1.328×107CFU/mL、1.660×107CFU/mL，对应的OD600nm值分别为0.307、0.724、0.833、1.181、1.435。以菌液OD600nm值（x）为横坐标，以菌浓度（y）为纵坐标作图，结果见图4。由图4可知，菌液OD600nm值与菌浓度二者关系曲线回归方程为y=1.182 6x-0.052 4，相关系数R2=0.992 2。结果表明菌液OD600nm值与菌浓度二者线性关系良好，样品中菌浓度可以按照此回归方程进行计算。

图4　酵母菌浓度与吸光度值关系曲线Fig.4 Relationship curve of yeast concentration and absorbance value

2.3.2分离酵母菌的耐糖性

虽然糖是酵母菌发酵产生酒精的基质，也是酵母菌赖以生存的碳源，但高浓度的糖也会抑制酵母菌株的生长，抑制其活性［20］，不同酵母菌株对糖的耐受性不同。分别测定不同菌株在不同糖含量液体培养基中培养24 h时的生长情况，结果见表2。

表2　不同葡萄糖含量下红提葡萄酵母菌的生长情况Table 2 Growth situation of yeast isolated from red grapes under different glucose content×107CFU/mL

由表2可知，所有分离酵母的生长量都随糖含量的增加而下降，即酵母菌的生长活性都随着糖含量的增加而降低。这是由于大部分酵母菌生长最适培养基YEPD中，糖含量才为2%，当糖含量为100 g/L时，已经远远大于最适培养基，因此随着碳含量的增加，菌含量会逐渐减少。但各菌株对糖的耐受性却有差别，与安琪酵母相比，分离酵母菌株耐糖性都好，在糖添加量为300 g/L的培养基中，都可以生长，A3和C1的耐糖性甚至稍高于安琪酵母；随着糖含量的增加，A1、B5和C6菌含量下降较快，因此这三种菌株的耐糖性稍差。结果表明，耐糖性较好菌株为A3、C1和B7。

2.3.3分离酵母菌的耐酒精度

当酒精含量达到一定浓度时，随浓度的增加，酵母的活性将被抑制，甚至当酒精含量足够高时，酵母的发酵会停止。酵母的发酵能力在很大程度上取决于它们自身酒精耐受力的大小［19］，将酵母菌菌悬液接种到不同酒精度的液体培养中，培养24 h时，其菌含量结果见表3。

表3　不同酒精含量下的红提葡萄酵母菌的生长情况Table 3 Growth number of yeast isolated from red grapes under different alcohol content×107CFU/mL

从刘向勇等［17］研究中可以看出，安琪酵母菌对酒精有较好的耐受性。以安琪酵母为参考，由表3可知，酵母菌C1耐酒精度最低，在酒精度为12%vol时，菌含量下降最快；菌株A1和C6耐酒精度较低，在酒精度为15%vol时，菌含量较低；菌株A3、B5和B7耐酒精度最高，在酒精度为15%vol时生长较好。因此，菌株A3、B5和B7进一步研究的价值较大。

2.3.4分离酵母菌的耐酸性

在酸性条件下，可抑制很多有害微生物的生长，耐酸性较好的酵母菌株应用范围必定较广，但如果pH值过于低，将会抑制所有微生物的生长［16］，因此，在野生酵母菌菌株的选育中，所选菌株的耐酸性是其留取的主要指标。对分离所得6株酵母菌的耐酸性进行测定，结果见表4。

表4　不同pH值下红提葡萄酵母菌的生长情况Table 4 Growth number of yeast from red grapes under different pH value×107CFU/mL

由表4可知，在pH值为4～6时，所有菌株生长都比较好，除了安琪酵母，所测菌株的最适pH值都在6附近。通过和安琪酵母比较，发现各菌株耐酸性却不同：在pH值为1时，C1生长最好，其次依次为A3、C6、B7，A1和B5两菌株生长量很少；A1和B5两菌株适合生长pH值范围较窄，当pH值低于4，生长非常弱；B7较A1和B5耐酸性稍强，但比较适合生长的pH值也集中在4～6。因此，在pH值为1～6，耐酸性较好的菌株为C1、A3、C6，菌株B7次之，菌株A1和B5耐酸性最差。

3　结论

总结以上结果可以得出以下结论：对红提葡萄自然发酵过程中的酵母菌进行分离，共得到140株菌，经菌落形态和细胞形态初步分析后，获得三类典型酵母菌，共6株。当6株菌混合发酵时，以红提葡萄酒自然发酵为对照，和安琪酵母作比较，分离酵母菌发酵糖产生CO2和酒精的利用趋势相同，且比自然发酵可多发酵1.6%葡萄糖，多产生0.78%CO2和0.82%vol的酒精，分离酵母菌的发酵能力较强。以安琪酵母为对照，对6株菌进行耐受性试验，发现菌株A3、B7和C1耐糖性比较好；菌株A3、B5、B7能耐较高酒精度；菌株A3、C1和C6耐酸性较好。综合评价可以得出：耐性最好的菌株为A3；其次为B7；由于菌株C1的耐酸性和耐糖性是最好的，耐酒精度为12%vol，也可和菌株A3、B7一起作为下一步重点研究的对象。

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JIA Chunfeng1，JIA Zhijun2，ZHU Weihong1，ZHANG Xiaomei1*
（1.Department of Biochemistry，Baoding University，Baoding 071000，China；2.Industrial and Commercial College，Hebei University，Baoding 071000，China）

Yeast strains were isolated from red grapes fermentation process，and its tolerance properties were researched in order to improve the brewing quality of red grape wine.Through cultivating strains in different fermentation period，colony and cell morphology of strains were observed by naked eye and microscope，respectively.The fermentation ability and the tolerance properties against sugar，acid and alcohol of stains were determined.The results showed that 140 strains of yeasts were isolated.By colony shape and cell morphology identification，three typical type's yeasts（total six strains）were obtained.During the fermentation process，the glucose，CO2and alcohol content in red grapes wine fermented by the separated strains were 1.6%，0.78%and 0.82%vol more than that of the natural fermentation，and the fermentation trend was consistent with angel yeast and natural fermentation process.With angel yeast as contrast，the tests results of six strains tolerance properties against sugar，acid and alcohol showed that strain A3，B7 and C1 had good comprehensive tolerance properties.

red grapes；yeast；isolation；tolerance properties

TS261.1

0254-5071（2016）06-0076-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.016

2016-02-15

保定市科学技术研究与发展指导计划项目（14ZN017）；院级自然课题（2012Z09）

贾春凤（1979-），女，副教授，硕士，研究方向为食品微生物及发酵工程。

张筱梅（1957-），女，教授，本科，研究方向为食品发酵技术。