冬果梨果酒酵母的筛选及鉴定

刘根娣，隋明

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；2.四川大学轻纺与食品学院，四川成都610065；3.四川工商职业技术学院酒类与食品工程系，四川都江堰611830）

冬果梨果酒酵母的筛选及鉴定

刘根娣1，隋明2，3*

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；2.四川大学轻纺与食品学院，四川成都610065；3.四川工商职业技术学院酒类与食品工程系，四川都江堰611830）

以冬果梨作为富集培养基，对野生酵母菌株进行收集、分离，得到980株；采用TTC平板法、耐乙醇性能测定以及产乙醇性能测定共三级筛选，最终筛得一株可耐受18%vol乙醇、乙醇产量达7.79%vol、发酵过程中糖利用率92.75%的菌株L-0301。通过对筛选所得菌株L-0301的形态特征观察、26S rDNA D1/D2区序列分析方法对菌株进行分类鉴定，结果显示，菌株L-0301为酵母亚科酵母属酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。

冬果梨；果酒；酵母；筛选；鉴定

果酒是以水果为原料经过发酵而成的低酒精度饮料，富含糖、有机酸、酯类及多种维生素［1］。目前，我国的果酒种类以葡萄酒为主，以其他果品发酵生产较少。我国幅员辽阔，果树种类众多，鲜果市场受到季节性和地域性的影响，即使价格低廉，亦难走向全国鲜果市场。果酒营养丰富市场广阔，货架期相对鲜果要长很多。因此，对此类果品进行深加工发酵生产果酒，既是对低品质水果的升值，又能因地制宜合理利用资源。

酵母菌（Saccharomyces）是一种在自然界分布较广的、能发酵糖类又具有较强还原氧化能力的单细胞真菌［2］，并将相关化学合成的醇、醛进行转化生产出乙醇。在果酒发酵的过程中，酵母菌是关键所在，优良的酵母菌株是决定果酒产量和品质的重要因素［3-4］。为了获得适合利用兰州冬果梨进行发酵产果酒的酵母菌株，本研究拟从未经任何处理的兰州冬果梨中采样，筛选产酒性能较好的菌株，从形态特征结合分子水平的26S rDNA D1/D2区序列分析方法对所筛得菌株进行分类鉴定。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1原料与试剂

冬果梨：兰州市售；菌株XA0、XA5、XA10、XA12、XA14、XA24、LC、LD：西北民族大学生命科学与工程学院微生物实验室提供；菌株AS2.587：甘肃省工业微生物菌种保藏中心；葡萄糖：广州和为化工有限公司；蛋白胨、琼脂：天津北辰方正试剂厂；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）：上海圻明生物科技有限公司；无水乙醇：广州市新成精细化工有限公司；以上化学试剂均为分析纯。脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒和胶回收试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2培养基

富集培养基：将冬果梨用粉碎机打碎，糖度及pH自然。

增殖培养基：麦芽汁液体培养基，自制，糖度12°Bx，自然pH，121℃灭菌20 min。

分离培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母提取物1%，琼脂2%，加蒸馏水溶解，自然pH值，121℃灭菌20 min。

活化培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母提取物1%，加蒸馏水溶解，自然pH值，121℃灭菌20 min。

生长培养基：经3 000 r/min离心处理10 min处理后的冬果梨汁，其中的糖近似于可溶性固形物，糖含量调节至20%，不足部分用蔗糖调节，121℃灭菌20 min。

TTC上层培养基：葡萄糖0.5%，琼脂1.5%，加水加热溶解，然后吸取9.5 mL加入试管中121℃灭菌20 min，加入5%TTC溶液使其浓度为0.5%，混匀。

TTC下层培养基：同生长培养基。

玉米粉琼脂Dalmau平板培养基：将42 g玉米粉加入1 L去离子水中60℃加热1 h，用滤纸过滤再加水至1 L，加入12 g琼脂溶解，121℃灭菌15 min。

诱导培养基（麦氏培养基）：葡萄糖0.1%，KCl 0.18%，酵母抽提物0.25%，CH3CO2Na·3H2O 0.82%，琼脂1.5%，加入蒸馏水，121 ℃灭菌15 min。

1.2仪器与设备

BCN-1360超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；LD4-8离心机：北京京立离心机有限公司；HZQ-QX全温振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；HB-119手持式糖度计：郑州南北仪器设备有限公司；SHP-250生化培养箱：上海森信试验仪器有限公司；DYCZ-20G型电泳仪、WD-9402B型基因扩增仪、WD-9413A凝胶成像分析系统：北京六一仪器厂。

1.3方法

1.3.1酵母菌的富集及分离

将冬果梨粉碎成糊状，置于自然环境中3 d进行富集。吸取1 mL冬果梨富集液放于装有20 mL增殖培养基的100 mL三角瓶中，于28℃、100 r/min条件下培养24 h。吸取1 mL含菌增殖培养基用无菌水稀释到一定梯度，均匀涂布于分离培养基中，于（28±1）℃倒置培养3～5 d后观察。

1.3.2酵母菌的筛选

一级筛选（TTC平板法）：按照参考文献［5］的方法进行。

二级筛选（耐乙醇性能测定）：按照参考文献［6］的方法进行。

三级筛选（产乙醇性能的测定）：将试验菌株于活化培养基活化后，吸取5 mL放入45 mL糖含量为30%（近似可溶性固形物）的发酵培养基中，先在28℃、100 r/min的条件下发酵24 h，在28℃静置发酵至72 h，然后测定发酵液中的乙醇含量及各菌株对冬果梨发酵液中糖的利用情况。

1.3.3酵母菌的鉴定

798 Effect of negative polarity electret on dielectric properties and hypoglycemic effects of insulin

参照《酵母菌的特征与鉴定手册》和《微生物学实验技术》［7-8］观察菌株的形态特征，设计生理生化试验，包括发酵糖类试验、同化碳源试验、同化氮源试验及其他生理生化试验等。

26S rDNA D1/D2区序列分析方法鉴定：在YPD斜面培养基上用接种环挑取少量旺盛生长的酵母菌细胞于50 μL PCR缓冲液中，变性后离心，取上清液作为模板［9］。在80℃、15 min的反应条件下，按参照文献［6］所提供的方法，提取DNA，检测后置于-20℃冰箱保藏备用。使用由上海生工公司合成的引物NL1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′）和NL4（5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′）［10］进行26S rDNA D1/D2区的目的片段扩增。PCR扩增体系条件为（50 μL体系）：PCR缓冲液1 μL，混合液5 μL，D1/D2正向引物（20 pmol/μL）0.5 μL，D1/D2反向引物（20 pmol/μL）0.5 μL，最后加dH2O 23 μL。PCR循环为：94℃预变性5 min，94℃变性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸1 min，循环30次；72℃保持5 min［11］。将得到的PCR产物交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化和测序。以Chromas作参照，对测序结果进行正反序列图谱人工校对，用校正后的26SrDNAD1/D2区序列在NCBI的GenBank数据库中进行序列的搜索（BLAST search），比较供试菌株与已知酵母菌相应序列的同源性。为了更进一步的了解供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及其分类地位，根据在NCBI的GenBank数据库中搜索得到的已知酵母菌的26S rDNA D1/D2区序列，并将其下载，与供试菌株序列一起用Clustal X［12］软件进行匹配排列，用MEGA5.05软件中的Kimura2-Paramete Distance模型及邻接法（Neighbor-joining，NJ）分析构建统发育树，并进行1 000次的Bootstraps检验［13］。

1.3.4检测方法

乙醇含量的测定方法：蒸馏法［14］；糖含量的测定方法：糖度计法。

2　结果与分析

2.1酵母菌的富集分离

从冬果梨中共分离得到980株酵母菌供一级筛选。

2.2酵母菌的筛选

2.2.1一级筛选

2.2.2二级筛选

从一级筛得到的136株性状较好的菌株，进行二级筛选，实验重复3次。分别在不同体积分数的乙醇溶液中培养72 h，并在生长期间的3个时间段分别观察了各发酵管的产气情况，结果见表1。由表1可知，菌株L-0239、L-0242、L-0245、L-0256、L-0257、L-0280、L-0292、L-0293、L-0301、 L-0305、L-0308、L-0311仍有的产气情况，说明这些菌株比其他菌株具有更强的乙醇耐受能力，其产生乙醇的能力也可能会更大。

表1　菌株耐乙醇测定结果Table 1 Determination results of ethanol-tolerance of strains

2.2.3三级筛选

用二级筛选所得的12株菌和其他实验室提供的8株菌进行试验。经发酵后，测定发酵液中的乙醇产量以及发酵前后醪液中的糖含量。结果见表2。

表2　乙醇产量测定结果Table 2 Determination results of ethanol yield

由表2可看出，菌株L-0301的乙醇产量在这20株菌中最高，达到7.79%vol，对冬果梨梨汁中的糖的利用率也最高，为92.75%，残糖最低为1.45%。

2.3菌株的鉴定

2.3.1菌株的形态特征

菌株L-0301的细胞形态特征为：培养液澄清、沉淀较多但结合不紧密、瓶壁无膜、无环岛状菌蹼；形状呈卵圆形、柠檬形；一端出芽或两端出芽，如图1所示。

图1　菌株L-0301细胞形态特征Fig.1 Cell morphology of strain L-0301

菌株L-0301的菌落形态特征为：菌落质地呈奶酪状，粘稠，乳白色，反光、光滑、无疣状脊状突起、无发毛样突起，平滑，有隆起，如图2所示。

假菌丝的观察：在玉米粉琼脂Dalmau平板上，培养基经过7 d的培养观察，发现无假菌丝形成。

子囊孢子观察：在诱导培养基上培养3 d后，挑取少许菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，l min后水洗，加95%vol乙醇20 s，水洗，最后用0.5%沙黄液复染20s，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干。制片干燥后，镜检，经过培养染色镜检后发现，菌株有子囊孢子的形成，每个子囊内的孢子数为5～8个，呈卵圆形，如图3所示。

图2　菌株L-0301菌落形态特征Fig.2 Colonial morphology of strain L-0301

图3　菌株L-0301子囊孢子特征Fig.3 Ascospores characteristics of strain L-0301

2.3.2生理生化试验

表3　菌株L-0301生理生化试验结果Table 3 Physiological and biochemical experiments results of strain L-0301

菌株L-0301的发酵糖类试验、同化碳源试验、同化氮源试验以及其他生理生化试验［15］结果见表3。根据试验结果参照《酵母菌的特征与鉴定手册》，初步确定菌株L-0301属于酵母属。

2.3.326S rDNA D1/D2区序列分析方法鉴定

用提取到的菌株L-0301的DNA作为模板，以引物NL1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′）和NL4（5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′）进行26S rDNA D1/D2区的目的片段扩增，再对PCR扩增产物进行凝胶电泳分析［16］，结果如图4所示。

图4　菌株L-0301 26S rDNA D1/D2区PCR扩增凝胶电泳图Fig.4 26S rDNA D1/D2 PCR amplification electrophoretogram of strain L-0301

由图4可见，PCR扩增产物大小在500～600 bp。菌株L-0301的PCR扩增产物经生工生物工程（上海）股份有限公司测序后可知其大小为586 bp的片段，结果如下：

登录NCBI数据库进行比对后可知，菌株L-0301与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）序列的相似度＞99%。同时采用MEGA 5.05软件Neighbor-Joining法将L-0301与其他相关菌株的26SrDNAD1/D2区的基因序列一起构建成了系统发育树，并进行1 000次的相似度重复性计算，结果如图5。由图5可见，系统发育树以Aspergillus flavus、Saccharom yces naganishii和Saccharomyces humaticus的26S rDNA D1/D2区的基因序列为外群，而L-0301则以较高的置信度和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）模式菌株CBS 1907T聚于内群的同一分支上，而与其他菌株分在不同的分支上，说明L-0301与酿酒酵母（Saccharomyces cere-visiae）模式菌株CBS 1907T具有较近的亲缘关系。将L-0301基因序列与相关模式菌株的26S基因序列进行同源性分析，从碱基序列的同源性来看，其与CBS 1907T的同源性为99%，L-0301与CBS 1907T应该属于同一物种，即菌株L-0301为酵母亚科（Saccharomycestoideae）酵母属（Saccharomyces）酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。

图5　基于菌株L-0301 26S rDNA D1/D2区基因序列构建的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequence alignment of strain L-0301

3　结论

通过对冬果梨中的酵母菌进行富集、分离，得到了980株酵母菌。以这些菌株作为出发菌株，通过TTC平板法、耐乙醇能力的测定以及产乙醇能力的测定共三级的筛选，最终得到了菌株L-0301，其具有良好的产乙醇性能以及乙醇耐受性能。通过初步的筛选发酵便可以得到更能耐受18%vol的乙醇，乙醇产量7.79%vol，发酵过程糖的利用率为92.75%。

本研究通过形态特征观察并结合26S rDNA D1/D2区序列分析的方法，对从冬果梨中分离筛选出的的野生菌株L-0301行了分类鉴定。菌株L-0301形态特征与《酵母菌的特征与鉴定手册》中阐述的酿酒酵母的性质相似。通过分子水平的26S rDNA D1/D2区序列分析，与相关酿酒酵母的模式菌株进行比较，进一步确定了菌株L-0301为酵母亚科（Saccharomycestoideae）酵母属（Saccharomyces）酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。本研究结果为以冬果梨为原料生产果酒的研究奠定了优良菌种的基础，有关该酵母菌的发酵特性及其利用价值还需做进一步研究。

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LIU Gendi1，SUI Ming2，3*
（1.College of Life Science and Engineering，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China；2.College of Light Industry，Textile&Food Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China；3.Department of Wine and Food Engineering，Sichuan Technology&Business College，Dujiangyan 611830，China）

980 wild yeast strains were isolated and screened from Dongguo pear.Using TTC plate method screening，ethanol tolerance determination and ethanol production determination，one strain L-0301 was screened，with the characteristic of 18%vol ethanol tolerance，ethanol yield 7.79%vol，sugar utilization ratio 92.75%.Strain L-0301 was identified through morphological characteristics observation，26S rDNA D1/D2 sequence analysis，the results showed that strain L-0301 wasSaccharomyces cerevisiae.

dongguo pear；fruit wine；yeast；screening；identification

TS261.1

0254-5071（2016）06-0085-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.018

2015-12-13

中央高校基本科研业务费专项资金项目（zyz2012073）；四川省教育厅课题（13ZB0363）

刘根娣（1977-），女，讲师，硕士，研究方向为果蔬产品开发及利用。

隋明（1986-），男，讲师，博士研究生，研究方向为发酵工程。