响应面法优化冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽工艺研究

武威，焦阳，陈晓平*

（1.吉林省标准研究院，吉林长春130022；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

响应面法优化冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽工艺研究

武威1，焦阳2，陈晓平2*

（1.吉林省标准研究院，吉林长春130022；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）

该研究利用Box-Behnken中心组合设计和响应面分析法，以五味子果仁冰醋酸抗菌肽对大肠杆菌的抑菌圈直径为响应值，对冰醋酸提取法提取五味子果仁中抗菌肽的工艺参数进行优化。结果表明，冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽最佳工艺条件为：冰醋酸浓度10%、料液比1∶28（g∶mL）、离心速率8 200 r/min。在此工艺条件下，所提取的抗菌肽对大肠杆菌的抑菌圈直径为2.13 cm，与理论值（2.10 cm）的相对误差仅为1.09%，表明拟合方程与实际相符合，所得结果准确可靠。

响应面法；冰醋酸提取；五味子果仁；抗菌肽

五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）是长白山重要的具有明显保健功能的特色植物资源之一［1-2］。木脂素类物质、多糖类化合物和肽类是五味子主要的功效成分。五味子具有极高的药用和食用价值，具有滋补、抗肿瘤、抗氧化等多种功效，因此，具有较高的研究和开发利用价值［3-5］。

抗菌肽是具有抗菌活性肽类的总称。作为多种生物机体内重要的防御物质之一，抗菌肽具有广谱性、热稳定性好、水溶性佳等众多优点，广泛存在于植物、动物等机体内［6-8］。植物抗菌肽的作用机制相对来说比较灵活，它可以破坏有害细菌的细胞壁或者溶解其细胞膜以及使其细胞的某些细胞器失去相应的功能来杀死有害细胞［9-11］。常用抗菌肽分离纯化的方法主要有：化学萃取法、超滤法、冻融法、酶解法、沉淀法、离心法、色谱分离法、层析法、电泳法等［12］。

本研究提取抗菌肽的方法主要是依照王雅丽等［13-14］采用的冰醋酸法及乙醇法提取鳗鲡、林蛙中抗菌肽的工艺方法。近年来对五味子活性成分的研究很多，但多集中于五味子的果肉部分，而对其果仁部分的研究鲜见报道［15-16］。本研究利用Box-Behnken中心组合设计和响应面分析法，以五味子果仁冰醋酸提取物对大肠杆菌（Escherichia coli）的抑菌圈直径为响应值，对冰醋酸浸提法的主要工艺参数进行优化，以期获得最佳提取工艺。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

五味子：长白山蓝景坊科技股份有限公司。

大肠杆菌（Escherichia coli）：吉林农业大学食品工程教研室保菌中心。

冰醋酸、乙醇（分析纯）：北京化工厂；琼脂粉：天津市科密欧化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠（分析纯）、氨苄青霉素（优级纯）：北京鼎国生物技术有限责任公司。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母抽提物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，以2 mol/L NaOH调节pH至7.4，121℃高压灭菌20 min。

LB固体培养基：在LB液体培养基中添加质量分数为1.5%的琼脂粉。121℃高压灭菌20 min。

1.2仪器与设备

XA-10固体样品粉碎机：金坛市科析仪器有限公司；SPA-250B-Z生化培养箱：上海博讯实业有限公司；HD-1360洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；RE-52A旋转蒸发器：、SHZ-Ⅲ循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；FA1004A电子天平：上海精天电子仪器有限公司；LG10-2.4A高速离心机：北京医用离心机厂；FD-1C-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1材料预处理

将五味子浸泡去果肉，所得果仁用蒸馏水洗净，放入60℃的烘箱内烘干至恒质量，破壳并入粉碎机内粉碎，过60目筛，制得五味子果仁干粉，备用。

1.3.2冰醋酸法提取五味子果仁抗菌肽［13-14］

称取5份5.000 g五味子果仁粉，按照一定的料液比分别加入100 mL一定浓度的冰醋酸，匀速搅拌20 min，于4℃条件下浸提1d后，置于4℃离心机中在一定转速条件下离心20 min，取上清液，70℃旋转蒸发将冰醋酸蒸干，冷冻干燥，灭菌水定容至10 mL，待进行抑菌试验。

1.3.3单因素试验

分别考察冰醋酸质量分数（4%、6%、8%、10%和12%）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、离心速率（6 000 r/min、7 000 r/min、8 000 r/min、9 000 r/min和10 000 r/min）对冰醋酸法提取五味子果仁中抗菌肽对大肠杆菌抑菌效果的影响。

1.3.4响应面法优化试验

表1　响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

在单因素试验基础上，以抑菌圈直径（Y）为响应值，利用Design-expert 8.0.6分析软件的Box-Behnken中心组合设计法对冰醋酸质量分数（A）、料液比（B）、离心速率（C）进行3因素3水平响应面优化分析［17-19］。响应面试验因素与水平见表1。

1.3.5抑菌活性测定

菌种活化：将大肠杆菌分别接种至LB液体培养基中，振荡培养基使菌种分散均匀，置于37℃培养箱内培养48 h，活化2～3次。

抑菌活性测定：抑菌活性采用琼脂孔穴扩散法测定［20-21］。吸取浓度为120 CFU/mL活化的菌种120 μL加入LB固体培养基中，涂布均匀，在培养基上打直径为5～6 mm的圆孔，用移液枪吸取50 μL抗菌肽粗提液加入孔洞。阴性对照组加50μL无菌蒸馏水，阳性对照组加50 μL 100 μg/mL的氨苄青霉素溶液。将培养基于37℃培养24 h。观察抑菌效果，并测量抑菌圈直径（平行测定3次，取平均值）。

1.3.6试验数据处理

运用软件Design-Expert 8.0.6获得回归方程进行数据处理。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1冰醋酸质量分数对五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影响

图1　冰醋酸浓度对五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影响Fig.1 Effect of glacial acetic acid concentration on antibacterial efficacy of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

由图1可知，在冰醋酸质量分数为4%～10%范围内，随着冰醋酸质量分数的增加，抑菌圈直径呈现增长的趋势；当冰醋酸质量分数为10%时，抑菌圈直径达到最大，为2.11 cm；当冰醋酸质量分数＞10%时，抑菌圈直径开始降低。因此，选择冰醋酸质量分数为10%较适宜。

2.1.2料液比对五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影响

由图2可知，随着料液比的增加，抑菌圈直径呈先增长后减小的趋势，当料液比为1∶30（g∶mL）时，抑菌圈直径达到峰值，为2.03 cm；当料液比＞1∶30（g∶mL），溶出的抗菌肽含量开始出现了降低趋势，抑菌圈直径随之降低，因此，选择料液比为1∶30（g∶mL）较适宜。

图2　料液比对五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on antibacterial efficacy of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

2.1.3离心速率对五味子果仁抗菌肽抑菌效果的作用

图3　离心速率对五味子果仁抗菌肽抑菌效果的影响Fig.3 Effect of centrifugal speed rate on antibacterial efficacy of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

由图3可知，抑菌圈直径随离心速率的提高先增加后降低。当离心速率为8 000 r/min时，抑菌圈直径达到峰值，为2.06 cm；当离心速率的持续增加（＞8 000 r/min）会使提取出的五味子果仁抗菌肽在离心过程中有所损失，最终导致抑菌圈直径开始降低，因此，选择离心速率为8 000 r/min较适宜。

2.2响应面法优化试验结果

2.2.1响应面试验结果

利用Design-Expert 8.0.6分析软件，采用Box-Behnken试验设计及响应面分析法，探讨冰醋酸质量分数（A）、料液比（B）、离心速率（C）及其交互作用对抑菌效果的影响，响应面试验结果与分析如表2所示，响应面数据方差分析结果见表3。

表2　响应面试验结果与分析Table3 Results and analysis of response surface experiments

续表

根据表2试验结果，运用软件Design-expert 8.0.6对响应值进行多元回归拟合应进行方差分析，得到五味子果仁抗菌肽提取工艺参数回归方程为：

表3　回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，该二次方程模型具有显著差异性（P＜0.05），R2=0.968 1，说明该模型拟合情况良好、可靠性较高。失拟项P值为0.060 0＞0.05，不显著，表明试验误差较小，未知因素对试验干扰少。因素A、A2、C2对抑菌效果有极显著的影响（P＜0.00 1）；因素B、C、B2、物料比和离心速率的交互项（BC）对抑菌效果有显著性的影响（P＜0.05）；冰醋酸浓度和料液比的交互项（AB）、冰醋酸浓度和离心转速的交互项（AC）对抑菌效果影响不显著（P＞0.05）。模型的信噪比为13.964＞4，表明选用响应面模型合理的。

2.2.2响应面交互作用结果分析

采用软件Design-expert 8.0.6做两两因素交互作用的响应曲面及等高线，确定冰醋酸质量浓度、料液比和离心转速对五味子果仁抗菌肽抑菌圈直径的影响，结果见图4。

图4　冰醋酸质量分数、料液比和离心速率交互作用对五味子果仁抗菌肽抑菌圈直径影响的响应曲面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between glacial acetic acid concentration，solid-liquid ratio and centrifugal speed rate on inhibitory zone diameter of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts

由图4可知，当转速为8 000 r/min时，冰醋酸质量分数和料液比所形成的曲面向下倾斜的幅度较大，表明冰醋酸质量分数和料液比对所提取的SFA的抑菌作用影响极为显著，当冰醋酸质量分数为接近10%左右，料液比接近1∶30（g∶mL）时，抑菌圈直径达到最大值。同时，等高线近乎于圆形时表明冰醋酸质量分数和离心速率的交互项对抑菌效果不显著。当料液比为1∶30（g∶mL）时，冰醋酸质量分数和离心速率所形成的曲面出现陡坡，表明冰醋酸质量分数和离心速率对五味子果仁抗菌肽的抑菌作用极为显著。冰醋酸质量分数的不断增加，抑菌圈大小先增加后减小。离心速率也表现出相同的规律。同时，图中等高线近乎于圆形，表明冰醋酸质量分数和离心速率的交互项对抑菌效果影响不显著。当冰醋酸质量分数为10%时，料液比和离心速率对SFA的抑菌效果影响显著。不断提升离心速率，抑菌效果先上升后下降。料液比与离心速率变化规律相似。

2.3冰醋酸法提取五味子果仁抗菌肽的最佳提取条件验证试验

经响应面法优化，确定冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽最佳工艺条件为冰醋酸质量分数10%、料液比1∶28（g∶mL）、离心速率8 200 r/min，在此条件下，进行3次重复试验，所得五味子果仁抗菌肽对大肠杆菌抑菌圈直径为2.13 cm，与理论值（2.10 cm）之间的相对误差仅为1.09%，表明拟合方程符合实际，试验所设计的最佳条件是准确可靠的。

3　结论

本研究在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken中心组合设计和响应面分析法，确定冰醋酸提取五味子果仁抗菌肽最佳工艺条件为冰醋酸质量分数10%、料液比1∶28（g∶mL）、离心速率8 200 r/min。在此最佳条件下，所得五味子果仁抗菌肽对大肠杆菌抑菌圈直径为2.13 cm，与理论计算值（2.10 cm）之间的相对误差仅为1.09%，表明该模型能够很好地预测实际的提取情况。对五味子综合利用和新型抗菌肽的研究与开发具有重要意义。

［1］黄晓东，任旷.五味子木脂素研究进展［J］.吉林医药学院学报，2010， 31（1）：46-49.

［2］国家药典委员会编.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社. 2000：48，197.

［3］史琳，王志成，冯叙桥，等.五味子化学成分及药理作用的研究进展［J］.药物评价研究，2011，34（3）：208-212.

［4］李立顺，时维静，马迅兵，等.北五味子种子和果肉中的活性成分比较［J］.食品科学，2012，33（16）：175-178.

［5］刘容旭，高辰哲，姜帆，等.五味子多糖对两种肠道肿瘤细胞的抑制作用的影响［J］.食品科学，2015，36（5）：192-196.

［6］REDDY K V R，YEDERY R D，ARANHA C.Antimicrobial peptides：premises and promises［J］.Int J Antimicrob Agents，2004，24（6）：536-547.

［7］苏翔，崔敬爱，陈晓平，等.蚂蚁抗菌肽的分离纯化及其活性［J］.食品科学，2013，34（9）：70-73.

［8］BULET P，STÖCKLIN R.Insect antimicrobial peptides：structures，properties and gene regulation［J］.Protein Peptide Lett，2005，12（1）：3-11.

［9］REDDY K V R，YEDERY R D，ARANHA C.Antimicrobial peptides：premises and promises［J］.Int J Antimicrob Agents，2004，24（6）：536-547.

［10］王军，庞广昌.抗菌肽抗菌机理的研究现状及趋势［J］.食品科学，2005，26（8）：526-528.

［11］陈晓平，詹冬玲，贾惠文，等.抗菌肽JaponicinⅡ基因真核表达载体的构建［J］.食品科学，2007，28（9）：395-397.

［12］李晓光，高勤，翁文，等.五味子有效部位及其药理作用研究进展［J］.中药材，2005，28（2）：156-159.

［13］王雅丽.中国林蛙皮肤抗菌肽的分离纯化及生物活性研究［D］.长春：吉林农业大学，2015.

［14］徐同玲.日本鳗鲡组织器官抗菌肽的分离与鉴定［D］.厦门：集美大学，2009.

［15］杨莹莹，陈晓平.响应面法优化大蒜抑菌物质超声波提取工艺的研究［J］.食品与发酵科技，2012，48（4）：37-41.

［16］陈晓平，于翠翠.响应面法优化微波辅助乙醇提取桑黄黄酮工艺的研究［J］.食品与发酵科技，2013，49（4）：31-36.

［17］赵岩岩，李帅，陈晓平，等.响应面法优化浸提大蒜抑制大肠杆菌成分工艺［J］.吉林农业大学学报，2012，34（5）：575-579，583.

［18］王永菲，王成国.响应面法的理论与应用［J］.中央民族大学学报：自然科学版，2005，14（3）：236-239.

［19］杨文雄，高彦祥.响应面法及其在食品工业中的应用［J］.中国食品添加剂，2005（12）：68-71.

［20］梁英.抗菌肽的来源及应用［J］.动物营养学报，2014，26（1）：7-16.

［21］沈萍，范秀容.微生物学实验（第三版）［M］.北京高等教育出版社，1996：85-100.

WU Wei1，JIAO Yang2，CHEN Xiaoping2*
（1.Jilin Provincial Institute of Standards，Changchun 130022，China；2.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Using the antibacterial circle diameter of antimicrobial peptide onEscherichia colias response value，the glacial acetic acid extraction technology parameters of antimicrobial peptide from fructus schisandrae nuts were optimized by the Box-Behnken central combination design and response surface methodology.The results showed that the optimum extraction conditions of antimicrobial peptide were glacial acetic acid concentration 10%，solid-liquid ratio 1∶28（g∶ml）and centrifugal speed rate 8 200 r/min.Under the conditions，the antibacterial circle diameter of antimicrobial peptide extracted onEscherichia coliwas 2.13 cm，compared with the theoretical value（2.10 cm），the relative error was only 1.09%.Results indicated that fitted equation was in accord with the actual，and the results was accurate and reliable.

response surface methodology；glacial acetic acid extraction；fructus schisandrae nuts；antibacterial peptide

TS201.3

0254-5071（2016）06-0109-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.023

2016-036-21

吉林省重点科技攻关项目（20050212-6）

武威（1974-），女，高级工程师，本科，研究方向为食品安全与标准。

陈晓平（1963-）男，教授，博士，研究方向为食品生物化学与功能食品。