红曲色素发酵分批补料工艺研究

顾澄琛，张朝晖，包莹玲，刘银兰，嘉晓勤

（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

红曲色素发酵分批补料工艺研究

顾澄琛，张朝晖，包莹玲，刘银兰，嘉晓勤*

（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

为了提高红曲菌（Monascus purpureus）FM-4000的红色素色价，采用优化种龄和接种量的方法，探索了分批补料发酵基质对红色素色价的影响。结果表明，最佳种龄为6 h二级种子液，接种量10%（V/V），在发酵48 h时补加20 g/L黄豆粉，在发酵84 h时补加0.5 mol/L氨水，在发酵96 h时补加60 g/L米粉。在此工艺条件下，摇瓶发酵红曲菌FM-4000的红色素色价达到135.61 U/mL，相对初始摇瓶红曲菌FM-4000的红色素色价提高了37.25%；在5 L发酵罐中对红曲菌FM-4000进行分批补料发酵培养，红色素色价可达145 U/mL。

红曲菌；红色素；分批补料发酵

红曲色素是红曲菌（Monascus）代谢过程中产生的一系列聚酮类化合物，其特点是色泽鲜艳、耐热性强、安全性高等［1］。随着人们对食品安全问题的日益重视，天然色素正受到人们越来越多的关注。目前对红曲色素的固态发酵有大量的报道［2-3］。而液态发酵有利于扩大化、自动化生产，并且发酵时间短、生产消耗少、产品纯度高，因此液态发酵红曲色素成为近年来的研究热点［4-5］。但目前对液态发酵红曲色素的补料工艺研究甚少［6］，邱鹏等［7］通过单因素试验对红曲菌发酵条件进行了优化，付荣霞等［8］利用正交试验设计，研究不同碳源、氮源、pH、装液量对红曲霉色价及菌体干质量的影响。分批补料发酵能使营养物质在某个阶段维持在一定浓度，既可保证发酵过程中基质的供给，又可以有效地在消除某些基质对产物合成所产生的阻遏或抑制效应，因此更有利于菌体生长和产物合成［9］。本研究对实验室保藏的红曲菌（Monascus purpureus）FM-4000液态发酵的种龄及接种量进行了优化，研究其补料发酵的合适条件，并在摇瓶发酵的基础上进行5 L发酵罐中红曲菌（M.purpureus）FM-4000分批补料发酵扩大培养，以期提高液态发酵红曲色素产量及色价。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1实验菌株

红曲菌（Monascus purpureus）FM-4000：浙江工业大学红曲研究所提供。

1.1.2培养基

种子培养基：淀粉30 g/L，NaNO32 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，黄豆粉10 g/L，玉米浆1%（V/V），pH自然，121℃灭菌30 min。

发酵培养基：米粉60 g/L，黄豆粉20 g/L，NaNO32 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，乳酸调节pH 4～5，灭菌前加入消泡剂（泡敌）1‰（V/V），121℃灭菌30 min。

1.1.3化学试剂

可溶性淀粉：南京化学试剂有限公司；NaNO3：上海化专实验二厂；KH2PO4：浙江中星化工试剂有限公司；MgSO4·7H2O：上海四赫维化工有限公司；乳酸：浙江中星化工试剂有限公司；乙醇：天津科密欧化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

MLS-3780型高压蒸汽灭菌锅：日本SANYO公司；SW-CJ-6型超净工作台：上海锦昱科学仪器有限公司；YP202N型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；721型可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；ZHWY-2102恒温摇床：上海智城分析仪器制造公司；PB-10型pH计：德国Sartorius公司；BIOSTATRB型5L发酵罐：德国Sartorius公司。

1.3方法

1.3.1培养方法

斜面培养：将保藏菌种转接至新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）试管，30℃恒温培养7 d。

种子培养：用无菌水洗下斜面上的菌体，制备孢子悬液。取孢子悬液5 mL接至装液量为100 mL/250 mL的种子培养基中，30℃、180 r/min培养48 h得到一级种子液。将一级种子液按10%（V/V）的接种量接种至装液量为100mL/250mL的种子培养基中，30℃、180 r/min培养24 h，得到二级种子液。

发酵培养：将二级种子液按8%（V/V）的接种量接种至装液量为100 mL/250 mL的发酵培养基中，30℃、180 r/min培养168 h。定时取样测定相关参数，测定结果为3个平行样的平均值。

1.3.2生物量的测定方法

生物量的测定采用湿重法。取2mL发酵液，12 000 r/min离心15min，取沉淀，加入1mL去离子水，混匀后12 000 r/min离心5 min，除去上清，称质量。

1.3.3色价的测定方法

胞外红色素色价测定方法：取2mL发酵液，12 000 r/min离心15 min，取上清；上清稀释至适当倍数，用721分光光度计在波长505 nm处测定吸光度值OD505nm。胞外红色素色价值的计算公式如下：

胞内红色素色价测定方法：取2mL发酵液，12000r/min离心15min，取沉淀；加入1mL体积分数为70%乙醇，混匀，超声10 min，静置30 min，12 000 r/min离心15 min，取上清；上清液稀释至适当倍数，用721分光光度计在波长505nm处测定吸光度值OD505nm。胞内红色素色价值的计算公式如下：

总色价=胞外红色素色价+胞内红色素色价

1.3.4红曲菌发酵液中总糖的测定方法

参照武发菊等［10］的3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法。

2　结果与分析

2.1二级种子种龄的优化

研究不同种龄的二级种子液对色素色价的影响，显微镜下观察不同种龄菌落及菌丝生长状态，结果如表1所示。由表1可知，二级种子培养6 h时，发酵液中菌丝短而粗壮，呈致密的网状结构，菌落呈絮状，致密，生长快（见图1）；随着二级种子种龄增加，菌体开始结成小球，导致菌球内部传质、传氧发生困难，难以到达菌球中心，形成中空型菌球，影响菌体的正常代谢及目标产物的合成，最终导致色素积累受到抑制。色价变化情况见图2。由图2可知，二级种子种龄为6 h时，色价最高，达到85.11 U/mL。因此，采用二级种子种龄6 h为宜。

表1　不同种龄二级种子菌落及菌丝形态Table1 Colony and mycelial morphology of the secondary seed of different inoculum ages

图1　二级种子培养6 h后菌落和菌丝形态Fig.1 Colony and mycelial morphology of secondary seed after culture 6 h

图2　不同种龄对发酵液总色价的影响Fig.2 Effect of different inoculum ages on total color value of fermentation broth

2.2接种量的优化

菌株在发酵液中的生长速度受接种量影响较大。研究发酵液中不同接种量对色价的影响，结果如图3所示。由图3可知，起初红色素色价随着接种量的增加而增加，当接种量达到10%时，红色素色价达到最高，为115.67 U/mL；但是当接种量为11%时，发酵液色价相对低。这可能因为一方面随着接种量增加，相应种子液中水解酶类增加，基质利用率增加；另一方面菌株迅速占据培养环境，形成优势菌，杂菌生长机会下降，这两方面共同导致色价逐渐增加；但是当接种量过大时，菌丝生长过快，造成溶氧不足，细胞快速衰老影响色价。因此，采用10%的接种量比较合适。

图3　不同接种量对发酵液总色价的影响Fig.3 Effect of different inoculum on total color value of fermentation broth

2.3碳源补加量对总色价的影响

残糖量在24 h后下降速率较快，当发酵进行到96 h时，发酵液残糖量几乎降为0，残糖变化情况如图4所示。为了保持发酵的继续，以不同质量浓度的大米粉为碳源，在96 h补加碳源，补加后发酵液最终色价情况如图5所示。

图4　发酵时间与残糖量的关系Fig.4 Relationship between fermentation time and residual sugar content

图5　补加不同质量浓度米粉对总色价和残糖量的影响Fig.5 Effect of different rice flour concentration on total color value and residual sugar concentration

由图5可知，随着补加米粉质量浓度的增加，色价逐渐升高，但是，当补加米粉质量浓度达到80 g/L时，色价降低。这可能是过高米粉质量浓度对菌体生长产生了抑制作用，影响色素积累。因此，选择在发酵96 h时补加60 g/L的米粉溶液，此时色价达到130.60 U/mL，残糖量为4.15 mg/mL。

2.4氮源补加量对总色价的影响

发酵过程中，菌体生长与氮源含量有很大关系。通过补加氮源，补充菌体发酵过程对氮源的消耗，提高色价。发酵过程中色价、pH、菌体湿质量变化曲线见图6。

图6　发酵过程中总色价、pH、菌体湿质量变化曲线Fig.6 Variation curve of total color value，pH and wet mass during fermentation

由图6可知，0～12 h菌体生长缓慢，属于菌体生长的迟滞期，色素生成量较少，pH为6.5左右；12～48 h菌体量迅速增长，达到0.73 g/mL，色素生成量增加；48～84 h阶段，是色素生成的黄金时期，菌体量相对稳定在0.83g/mL。84～120 h，菌体生长呈现衰退，菌体量下降，色价依然缓慢上升，在发酵96 h时色价达到115.80 U/mL，此后色价下降，这与菌体开始出现自溶，产色素能力下降有关。

在发酵48 h时分别补加不同氮源（质量浓度为2 g/L），探究快速生长期补加氮源对色价的影响，结果见图7。

图7　不同氮源对总色价的影响Fig.7 Effect of different nitrogen sources on total color value

由图7可知，使用无机氮源（NaNO3、氨水）后色价较低，分别是85.40 U/mL，60.61 U/mL；而使用有机类氮源（黄豆粉、牛肉膏、蛋白胨）后，色价分别达到120.51 U/mL、123.06 U/mL和115.90 U/mL。这与有机氮源中含有的生长因子和一些无机盐极大地促进了菌丝体生长量［11］，从而促进色素发酵过程的积累［12-14］有关，考虑到实际生产中的成本问题，选择黄豆粉作为补加氮源。

考察黄豆粉的添加量对总色价影响，结果见图8。由图8可知，在红曲菌（Monascus purpureus）FM4000发酵液中色价随黄豆粉质量浓度增加而上升，在黄豆粉质量浓度为20 g/L时，色价达到最高，为123.80 U/mL。但当补加黄豆粉质量浓度＞20 g/L后，发酵液中菌体生物量继续增加，但色价却没有随之增加，反而降低。产生这种现象的原因可能是培养基中黄豆粉质量浓度过高导致了发酵液氮源十分充足，被大量用于生产菌体，而抑制了次级代谢产物的生成。因此，在发酵48 h时添加20 g/L黄豆粉。

图8　黄豆粉添加量对总色价及菌体湿质量的影响Fig.8 Effect of soybean powder addition on total color value and biomass

2.5氨水补加量对总色价的影响

在84～120 h菌体生长进入衰亡期，此时pH在5.5～4.5时，接近发酵终点。此时根据红曲色素代谢途径中存在的加氨反应，在发酵84 h时通过补加氨水，促进橙色素向红色素转化。研究不同氨水浓度对色价的影响，结果见图9。

图9　不同浓度氨水对总色价及菌体湿质量的影响Fig.9 Effect of different ammonia concentration on total color value and biomass

由图9可知，氨水补加浓度为0.5 mol/L时，发酵液色价达到最高，为135.61 U/mL，相对初始摇瓶红曲霉色素色价提高了37.25%；而过高浓度的氨水导致菌体分解，从而抑制了红色素的生成。因此，在发酵84h补加0.5mol/L氨水溶液。

2.6发酵罐补料分批发酵

图10　红曲菌FM-4000在5 L发酵罐分批补料发酵过程中pH（A）、生物量（B）、残糖量（C）及总色价（D）的变化Fig.10 Changes of pH（A），biomass（B），residue sugar content（C）and total color value（D）duringM.purpureus FM-4000 fed-batch fermentation in 5 L fermenter

综合上述优化后条件，进行5 L发酵罐补料验证试验。控制参数为：0～24h，转速300r/min，调节通气量为0.5vvm；24～84h，转速500r/min，条件通气量为0.7vvm；84～132h，转速400r/min，调节通气量为0.3vvm。分别在24h补加20g/L黄豆粉溶液，在132 h补加0.5 mol/L氨水溶液，发酵84 h、120 h分别补加60 g/L米粉溶液，每隔12 h取样检测发酵液的pH、菌体湿质量、残糖量及总色价，发酵过程曲线如图10所示。

由图10可知，在24 h补加有机氮源黄豆粉，同时，残糖量下降较快，这与红曲菌（M.purpureus）FM-4000处于快速生产期，代谢旺盛有很大关系。在发酵84 h、120 h时，发酵液中残糖含量很低，因此在84 h、120 h处补加米粉。在132 h补加氨水溶液，色素最终产量达到145 U/mL。

3　结论

在摇瓶中优化产红色素红曲菌M.purpureusFM-4000二级种子的培养时间、接种量，并探索补加碳源、补加氮源对总色价的影响。结果表明：以6 h培养二级种子，10%（V/V）接种量，在48 h时补加20 g/L黄豆粉，在84 h补加0.5 mol/L氨水，96 h补加60 g/L米粉溶液，摇瓶发酵红色素的色价达到135.61 U/mL，相对初始摇瓶色素色价提高了37.25%；在摇瓶培养的基础上，在5 L发酵罐中对M.purpureusFM-4000进行分批补料［15-16］发酵培养，红色素色价可达145 U/mL。

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GU Chengchen，ZHANG Zhaohui，BAO Yingling，LIU Yinlan，JIA Xiaoqin*
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

In order to improve the color value of red pigment produced byMonascus purpureus，the inoculum age and inoculum were optimized，and the effect of fed-batch fermentation substrate on the color value of red pigment was researched.Results showed that the optimum conditions were inoculum age 6 h，inoculum 10%（V/V），feeding 20 g/L soybean meal at fermentation 48 h，0.5 mol/L aqueous ammonia at 84 h and 60 g/L rice flour at 96 h.Under the conditions，the color value of red pigment produced byM.purpureusFM-4000 in shake flask fermentation was up to 135.61 U/ml，which was 37.25%higher than that before optimization.The color value of red pigment was up to 145 U/ml afterM.purpureusFM-4000 fed-batch fermentation in 5 L fermentor.

Monascus purpureus；red pigment；fed-batch fermentation

TQ92

0254-5071（2016）06-0133-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.028

2016-05-03

国家文物局指南针计划项目（No.20130306）

顾澄琛（1989-），女，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

嘉晓勤（1972-），男，副教授，博士，研究方向为微生物分子生物学和微生物发酵工程。