苯扎贝特促进小鼠体内胆固醇逆转运的研究

骆杨平，郑昭芬，傅庆华，胡勇军，谢 琼

（湖南师范大学第一附属医院 ，湖南省人民医院，长沙 410002）

苯扎贝特促进小鼠体内胆固醇逆转运的研究

骆杨平，郑昭芬，傅庆华，胡勇军，谢 琼

（湖南师范大学第一附属医院 ，湖南省人民医院，长沙 410002）

目的 检测苯扎贝特干预后小鼠血脂浓度，以及血清、肝脏及粪便中3H-胆固醇占经腹腔注射3H-胆固醇总量的百分比，探讨苯扎贝特对小鼠体内胆固醇逆转运的影响。方法 35只C57BL/6小鼠随机分为5组，分别给予普通饲料、不同剂量的苯扎贝特（0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）添加普通饲料喂养4周后，腹腔注射经ac-LDL及3H-胆固醇处理过的小鼠巨噬细胞悬液（0.5 mL/鼠，细胞数达5.0×106），单独笼养24h后取血，酶法测定血脂；测定血清、肝脏和粪便中的3H-胆固醇含量（占注射总量的百分比）。结果 不同剂量苯扎贝特（0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）干预小鼠后，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）升高并呈剂量相关性趋势。0.75%苯扎贝特组HDL-C水平较对照组明显增高，增幅为30.3%；血清甘油三酯（TG）水平较对照组明显降低，降幅为40.3%。苯扎贝特干预各组（0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）小鼠血清、肝脏、粪便3H的总含量显著增多，苯扎贝特干预组（0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）小鼠粪便3H-胆固醇含量较对照组增幅分别为+1.11，+1.40，+1.60，+1.70倍。结论 苯扎贝特剂量依赖性增加HDL-C和降低TG，能加速胆固醇由粪便清除，促进体内胆固醇逆转运，利于动脉粥样硬化的防治。

苯扎贝特；胆固醇逆转运；动脉粥样硬化

大量临床流行病学研究发现血浆中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平与心血管疾病的发病率呈正相关，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平与其呈负相关［1］。研究证实升高HDL-C水平和/或改善HDL功能能降低心血管病发病率和死亡率。胆固醇逆转运（RCT）是是HDL抗动脉粥样硬化的重要机制之一。苯扎贝特（Benzafibrate）是目前临床上常用的调血脂药物，可以明显降低甘油三酯（TG）和升高HDL-C。苯扎贝特能有效延缓动脉斑块的形成，降低冠心病患者的临床终点事件，提示苯扎贝特具有抗动脉粥样的作用［2］。苯扎贝特抗动脉粥样硬化的机制除了与其调节血脂作用外，还具有调脂外的作用。本研究采用一种替代方法测定胆固醇的逆转运效率，即给苯扎贝特干预的小鼠腹腔注射3H-胆固醇标记的巨噬细胞，24小时后检测血清及粪便中氚（3H）的放射活性。测定苯扎贝特作用后小鼠体内胆固醇逆转运的效率，从而了解苯扎贝特对小鼠血脂和在体胆固醇逆转运的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物与试剂 35只10周龄健康雄性C57BL/6小鼠购自北京协和医科大学实验动物中心，（体重22～25 g），SPF级动物，饲养在中南大学湘雅二医院实验动物中心SPF级饲养房中。RAW264.7巨噬细胞株购自中国科学院上海细胞库。苯扎贝特药粉由天津天士力药业集团提供。胎牛血清购自美国HyClone公司，DMEM培养基购自美国Sigma 公司，Ac-LDL购自中国科学院协和生化研究所，其余试剂为国产。

1.2 动物干预 10周龄C57BL/6小鼠35只（毛细管眶内取血75 µL，酶法测定血脂均相似），随机分为5组即：（1）对照组： 普通饲料饲养；（2）0.1%苯扎贝特组： 普通饲料添加0.1%苯扎贝特饲养；（3）0.25%苯扎贝特组：普通饲料添加0.25%苯扎贝特饲养；（4）0.5%苯扎贝特组： 普通饲料添加0.5%苯扎贝特饲养；（5）0.75%苯扎贝特组： 普通饲料添加0.75%苯扎贝特饲养。均给予饲料饲养，小鼠平均摄食量为4.2～4.5g/只/天，自由饮水。4周后，给小鼠腹腔注射制备好的巨噬细胞悬液（0.5 mL/鼠），之后单独笼养24h。用1%戊巴比妥0.1 mL腹腔注射麻醉后摘取眼球取血于EP管中，12 000 r· min-1离心5 min，取20 µL血清进行液闪记数，计算血液总的放射活性，及占注射总量的百分比。另外，取200 µL血清行血脂检测。

1.3 细胞培养及干预 RAW264.7小鼠巨噬细胞培养条件： 37℃，5% CO2，100%湿度培养箱，10%胎牛血清DMEM培养液。制备干预液： 取所需 Ac-LDL（终浓度Ac-LDL50 μg/ mL）于15 mL离心管，加入所需H3-胆固醇（干预浓度5 μ Ci/ mL），37℃孵育30 min，再加入所需量的DMEM培养液，混匀，将制备好的干预液加至培养瓶，细胞放于37℃培养箱培育48 h。收获干预好的细胞，并预备给小鼠腹腔注射： 胰酶消化细胞，细胞吹散离心后加入预冷的DMEM冲洗2遍，1000 r/m离心2 min，将细胞悬浮于不含FBS的DMEM，调整细胞数为1×105/ mL后，细胞悬液转移至1 mL注射器（置于冰上）；吸取剩余的细胞悬液80 µL 3次，分别放置于3个EP管中，离心后，各吸取10 µL上清，用液闪计数仪进行计数，吸除剩余上清，加入200 µL正己烷/异丙醇（3∶2），混匀，离心，吸取有机相于液闪瓶内，真空干燥，加入液闪液进行计数（计算出细胞内和上清液计数的比例，细胞内应＞95%）0.5 mL/鼠，剩余的细胞悬液分别测定细胞及上清的放射活性，保证上清所占比例少于5%，注射悬液的放射活性为6.2×106cpm。

1.4 粪便处理 收集单独笼养小鼠所有粪便，用镊子拣取小鼠粪便至EP管中并称重，将其转移至研钵中（理想的粪便浓度为1.6g·14 mL-1溶剂，即相当于114g·L-1），加入50%乙醇溶液溶解粪便使其浓度为114g·L-1，充分混匀1～2 min，取200 µL混匀液至20 mL液闪瓶内，加入10 mL液闪液，振荡混匀，过夜；第二天再振荡液闪瓶，进行液闪记数。计算粪便总的放射活性，并计算其占注射活性的百分比。

1.5 肝脏脂质抽提 处死小鼠，取肝脏组织用冷生理盐水冲洗后，用滤纸吸干，称重，-20℃保存。准确称取10mg冰冻肝组织放入匀浆器，，加入200 µL提取剂正己烷/异丙醇（3∶2），充分振摇10 min，收集上清夜，再重复抽提2遍，真空干燥，将干燥脂质溶于2 mL闪烁液，振荡混匀，即可作为分析样品进行液闪记数，计算肝脏总的放射活性，及占注射总量的百分比。

1.6 血脂测定 采用常规方法测定血脂全套，包括血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和高密脂蛋白胆固醇（HDL-C）。按Friedewald公式计算血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度LDL-C（mmol/L）=TC-HDL-CTG/2.2（当TG＜4.5 mmol/L时）。

1.7 统计学处理 应用SPSS13.0 统计软件包进行统计分析，对主要指标进行正态性检验，正态分布的统计指标均以均数±标准差表示。采用one-way ANOVA分析来进行组间比较。 P＜0.05 为差异有显著性。

2 结果

2.1 苯扎贝特干预后小鼠的血脂情况 不同剂量苯扎贝特干预后TC、LDL-C无明显变化，随着苯扎贝特剂量的增加HDL-C呈上升趋势。0.5%、0.75%苯扎贝特组HDL-C水平较对照组明显增高（P＜0.01），增幅分别为26.4%、30.3%，同时TG水平较对照组明显降低（P＜0.01），降幅分别为34%、40.3%。见表1。

2.2 苯扎贝特干预后小鼠的3H -胆固醇分布情况分别测定腹腔注射同位素标记细胞24 h后血清、肝脏和粪便中的3H-胆固醇含量（占注射总量的百分比）。不同剂量苯扎贝特（0.1%，0.25%，0.5%，0.75%）干预组小鼠血清3H-胆固醇含量较对照组显著增加，增幅分别为100%，131%，110%，115%。不同剂量苯扎贝特（0.1%，0.25%，0.5%，0.75%）干预组小鼠肝脏3H-胆固醇含量较对照组显著增加，增幅分别为86.4%，52.3%，51.6%，52.6%，不同剂量苯扎贝特（0.1%，0.25%，0.5%，0.75%）干预组小鼠粪便3H -胆固醇含量较对照组显著增加，增幅分别为110%，140%，160%，170%。见表2。

表1 苯扎贝特干预后小鼠的血脂变化

表2 苯扎贝特干预后小鼠的3H -胆固醇分布变化

3 讨论

胆固醇逆转运（RCT）是机体排出过多胆固醇的唯一途径，也是高密度脂蛋白（HDL）抗动脉粥样硬化的重要机制之一［1］。HDL能促进过多的胆固醇从外周组织转运到肝脏，以胆汁酸的形式分泌到小肠，由粪便排出，此过程称为胆固醇逆转运［3］。但测定血液胆固醇至粪便的净排除非常困难。Zhang［4］等应用同位素3H-胆固醇标记巨噬细胞注射小鼠腹腔，通过测定血清、粪便相应的同位素活性反映胆固醇的逆转运效率。本研究在其方法基础上建立一种替代方法测定胆固醇的逆转运效率，即给苯扎贝特干预的小鼠腹腔注射3H-胆固醇标记的巨噬细胞，24小时后检测小鼠血清及粪便中氚（3H）的放射活性。通过测定苯扎贝特作用后小鼠体内胆固醇逆转运的效率，评估苯扎贝特对小鼠血脂和在体胆固醇逆转运的影响。

苯扎贝特是目前常用的调脂药物，能显著降低甘油三酯（TG），中度降低总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），并能升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），能有效地延缓动脉粥样硬化病变发展的进程，降低冠心病患者的临床终点事件发生的危险性［5］。苯扎贝特的抗动脉粥样硬化机制除了与其调节血脂如降低甘油三酯和升高HDL-C外，还具有调脂外的作用。

巨噬细胞RCT对动脉粥样硬化的发展起着最为关键的作用［6］。巨噬细胞吞噬LDL后，大量胆固醇的过度堆积形成泡沫细胞，沉积于血管壁形成早期的粥样硬化病变。因此，巨噬细胞胆固醇逆转运构是体内过多胆固醇清除的有效途径。通过减少巨噬细胞胆固醇的堆积，促进巨噬细胞胆固醇逆转运，可抑制动脉粥样硬化的发生、发展。本实验测定了小鼠血清、肝脏和粪便中的3H-胆固醇活性。标记的3H-胆固醇从巨噬细胞流出至血液，再由HDL转运至肝脏，以胆汁酸盐形式分泌，之后随粪便排出。通过此研究方法，证实了体内多余胆固醇的逆转运过程。我们观察到苯扎贝特干预后，小鼠血清中3H-胆固醇含量增加，肝脏及粪便中3H胆固醇含量增多。结果表明苯扎贝特不仅能促进巨噬细胞胆固醇流出，而且可促进体内胆固醇的逆转运。

流行病学研究发现血浆中HDL-C水平与心血管病事件发生率呈独立的负相关。HDL不仅接受从巨噬细胞流出的胆固醇，而且能将胆固醇转运到肝脏，因此能促进巨噬细胞胆固醇逆转运［7］。苯扎贝特能使TC降低10%～20%，TG降低20%～60%，HDL-C升高10%～30%［8］。在BIP研究中，苯扎贝特使心脏病死亡、非致死性心肌梗死减少17%，这种临床获益可能与升高HDL-C有关［9］。本研究观察到苯扎贝特干预小鼠4周后，小鼠血清脂质谱发生明显变化： 苯扎贝特剂量依赖性增加HDL-C、降低TG。结合本研究苯扎贝特促进了巨噬细胞胆固醇逆转运，我们认为苯扎贝特升高HDL-C水平对促进巨噬细胞RCT有积极意义，对于延缓动脉粥样硬化的发生发展亦有重要意义。

通过增加HDL-C浓度、促进巨噬细胞胆固醇逆转运是目前动脉粥样硬化心血管疾病最具发展前景的治疗靶点，也是评价动脉粥样硬化治疗措施的依据［1］。苯扎贝特升高HDL-C水平，促进巨噬细胞胆固醇逆转运，发挥抗动脉粥样硬化作用。

［1］ Mahdy Ali K， Wonnerth A， Huber K， et al. Cardiovascular disease risk reduction by raising HDL cholesterol--current therapies and future opportunities［J］. Br J Pharmacol， 2012 ； 167（6）： 1177-1194.

［2］ Tenenbaum A， Fisman EZ. Fibrates are an essential part of modern anti-dyslipidemic arsenal： spotlight on atherogenic dyslipidemia and residual risk reduction［J］. Cardiovasc Diabetol， 2012， 11： 125.

［3］ Farmer JA， Liao J. Evolving concepts of the role of high-density lipoprotein in protection from atherosclerosis［J］. Curr Atheroscler Rep，2011， 13（2）： 107-114.

［4］ Tanigawa H， Billheimer JT， Tohyama J， et al. Expression of cholesteryl ester transfer protein in mice promotes macrophage reverse cholesterol transport［J］. Circulation， 2007， 116（11）： 1267-1273.

［5］ Goldenberg I， Benderly M， Goldbourt U. Update on the use of fibrates：focus on bezafibrate［J］. Vasc Health Risk Manag， 2008， 4（1）： 131-141.

［6］ Yves L. Marcel， Mireille Ouimet， ming-Dong Wang. Regulation of cholesterol efflux from macrophages［J］. Curr Opin Lipidol， 2008， 9：455-461.

［7］ Gordts SC， Singh N， Muthuramu I， et al. Pleiotropic Effects of HDL： Towards New Therapeutic Areas for HDL-Targeted Interventions［J］. Curr Mol Med， 2014； 14（4）： 481-503.

［8］ Bandgar BP， Sarangdhar RJ， Fruthous K， et al. Synthesis and biological evaluation of ester prodrugs of Benzafibrate as orally active hypolipidemic agents［J］. Eur J Med Chem， 2012， 57： 217-224.

［9］ Goldenberg I， Boyko V， Tennenbaum A， et al. Long-term benefit of high-density lipoprotein cholesterol-raising therapy with bezafibrate：16-year mortality follow-up of the bezafibrate infarction prevention trial ［J］. Arch Intern Med， 2009， 169（5）： 508-514.

Benzafibrate promotes reverse cholesterol transport from macrophage to feces in mice in vivo

Luo Yang-ping， Zheng Zhao-fin， Fu Qing-hua， Hu Yong-jun， Xie Qiong
（Hunan Provincial People Hospital， Changsha， 410002， China）

［Abtract］ Objective This study is to observe affect of benzafibrate on serum paraoxonase-1 activity in mice during the acute phase response and to investigate the mechanism by which it has anti-oxidized effect. Serum lipid profiles of mice were tested after bezafibrate ad ministration. The3H-cholesterol contents in serum， liver and feces in mice were measured to explore the effect of bezafibrate on reverse cholesterol transport from macrophage to feces in vivo. Methods 35 male C57BL/6 mice were rando mLy divided into four groups and treated with ordinary diet or plus different dosage （0.1%、0.25%、0.5%、0.75% W/W） of bezafibrate for 4 weeks， then these mice were injected intraperitoneally with 3H-cholesterol-labeled and cholesterolloaded raw264.7 macrophages （0.5 mL/mice， the amount of cells achieve 5.0×106）. Serum lipid profiles were deter mined by enzymatic method. Serum and liver tissues were harvested at 24h， feces were collected. And all samples were analyzed for the appearance of 3H-tracer （as the percentage of the total injected counts）. Results 1.Bezafibrate （0.1%、0.25%、0.5%、0.75%）dose-dependently reduced the levels of triglyceride （TG） and increased the level of HDL-C. In contrast to the control， the level of HDL-C was increased by 30.3% while the level of TG was decreased by 40.3% in 0.75% bezafibrate groups. 2. After 24 hours intrapentoneally injected， the3H-cholesterol levels of serum and liver in the mice treated with different dosage of bezafibrate （0.1%、0.25%、0.50%、75%） were significantly higher comparing with those in the control. the feces 3H-cholesterol levels in the mice treated with different dosage of bezafibrate （0.1%、0.25%、0.5%、75%） were significantly higher by 110%，140%，160%，170% comparing with those in the control. Conclusion Bezafibrate significantly and dose-dependently reduces the levels of triglyceride （TG） and increases the level of HDL-C； Bezafibrate promotes cholesterol reverse transport in vivo， accelerates clearance of cholesterol via feces， so it will be in favor of the prevention of atherosclerosis.

Benzafibrate； Reverse cholesterol transport； atherosclerosis.

R96

A

1673-016X（2016）02-0019-04

2015-08-20

湖南省自然科学基金（13jj5020）

骆杨平，E-mail： betterluoyp@sina.com