促血管生成素-1在心肌梗死大鼠脐血干细胞移植促进血管新生中作用

赵瑞平，韩炜，李洪宇，孙凯，胡江

· 论著 ·

促血管生成素-1在心肌梗死大鼠脐血干细胞移植促进血管新生中作用

赵瑞平1，韩炜1，李洪宇1，孙凯2，胡江3

目的 探讨人脐血干细胞移植于心肌梗死大鼠后是否通过促血管生成素-1（Ang-1）介导血管再生。方法 雄性Sprague-Dawley大鼠40只，随机分为3组，经手术干预后死亡10只，假手术组（9只）、对照组（11只）及移植组（10只）。假手术组仅开胸，冠状动脉前降支（LAD）挂线不结扎；对照组结扎LAD造成心肌梗死后，经静脉注射生理盐水；移植组结扎LAD造成心肌梗死后，经静脉注射等量干细胞悬液，术后4周处死大鼠，留取心脏左室组织。免疫组化染色人特异性心肌肌钙蛋白T（cTnT）、人主要组织相容性复合体（hMHC）、VIII因子、Ang-1蛋白，RT-PCR检测心肌组织Ang-1的mRNA表达水平。结果 在移植组可见胞浆呈褐色的cTnT和hMHC阳性细胞。与假手术组比较，对照组和移植组Ang-1免疫组化染色积分光密度（IOD）值明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，移植组Ang-1免疫组化染色IOD值明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与假手术组比较，对照组和移植组Ang-1 mRNA的相对表达明显增加，同时与对照组相比，移植组Ang-1 mRNA相对表达也明显增加，差异有统计学意义（P均＜0.01）。Ⅷ因子为心肌毛细血管密度测定指标，移植组梗死周边区毛细血管密度较对照组明显增加，而假手术组无明显变化。结论 经静脉移植人脐血干细胞能在心肌梗死大鼠梗死心肌存活并表达心肌特异性收缩蛋白，同时心肌毛细血管密度增加，其机制可能为Ang-1表达增加进而促进血管新生。

干细胞；Ang-1；Ang-2；心肌梗塞；脐血干细胞；促进血管新生

目前，心肌梗死的主要治疗方法包括常规药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术等。这些治疗方法能及时挽救缺血顿抑心肌，改善预后。但无法使已梗死的心肌细胞再生，不能有效阻止心室重塑。此外，对于冠状动脉弥漫性狭窄的患者，上述治疗也不能起到心肌再血管化的作用。近年来，干细胞移植治疗在这一方面显示出广阔的前景。自Orlic等［1］2001年在NATURE上报道骨髓干细胞能分化为心肌细胞后，大量的基础与临床研究［2-4］均证实了干细胞的安全性和有效性。用于治疗的干细胞种类包括胚胎干细胞、脐血干细胞、骨骼肌成纤维细胞、骨髓间充质细胞和内皮祖细胞等［5，6］。脐血干细胞的主要优势包括：①具有多种分化潜能，既可分化为心肌细胞，也可分化为新生血管内皮细胞等；②较骨髓或骨骼肌起源的干细胞，具有更强的增殖分化潜能；③受环境影响小，携带异常基因更少；④取材方便，不会对供体产生伤害［7］。基于上述原因，脐血来源的干细胞将成为细胞移植治疗心肌梗死的重要细胞。

另有研究证实，血管内皮生长因子（VEGF）、促血管生成素-1（Ang-1），促血管生成素-2（Ang-2）和基质细胞衍生因子在血管新生中都起到重要作用。VEGF与其受体结合能促进形成不成熟的渗漏的血管，血管生长素（Ang）可增加缺血性心脏病的侧支循环，Ang-1与其受体结合后可促进血管成熟、稳定。Ang-2是Ang-1的拮抗剂，在VEGF存在的情况下能进一步促进毛细血管新生。人脐血干细胞是否通过这些因子的作用而促进血管新生尚不清楚。

本研究从脐带血中分离干细胞，将其移植于心肌梗死大鼠模型中，观察移植脐血干细胞对心肌梗死后大鼠心脏血管新生的影响，并探讨Ang-1在血管新生中的作用。

1　材料与方法

1.1试剂和实验动物分组 雄性Sprague-Dawley大鼠40只，体重200～250 g，北京友谊医院动物实验室提供，无特殊病原体；兔抗大鼠Ⅷ因子抗体，购自北京中杉有限公司；鼠抗人cTnT单抗，购自北京迈新有限公司；鼠抗人MHC单抗，购自北京中杉有限公司；兔抗大鼠Ang-1单抗，购自武汉博士德有限公司。随机分为3组，假手术组（13只）、对照组（13只）以及移植组（14只）。

1.2脐血干细胞分离和提取 脐带血来自北京市脐血干细胞库，均采自无妊娠合并症、身体健康者，捐献者自愿捐献且同意用于科学研究和临床治疗。共用脐血5份，一次性血袋取血80～120 ml，6 h内分离，测CD34+含量在0.35%～0.42%之间，4 h内进行尾静脉注射。

1.3心肌梗死动物模型制作和细胞移植 对照组和移植组动物均用10%水合氯醛0.3 ml/100 g进行腹腔麻醉。麻醉成功后，将动物放置在实验台上，固定，连接呼吸机、心电监护仪。大鼠左侧胸部备皮、消毒、铺巾，逐层分离，暴露肋间肌，切开第4、5肋间肌，暴露心脏。辨别左心耳和动脉圆锥，在动脉圆锥和左心耳间，在距左心耳下1 mm处（相当于左前降支近端）用Prolene线结扎。其中假手术组只挂线不结扎。左室前壁颜色变白、活动减弱和心电图ST段明显抬高作为模型成功标志。对照组和移植组在术后24 h内经尾静脉分别注射0.5 ml生理盐水和0.5 ml人脐血基质细胞（hUCBSC）悬液（含干细胞2×107/ml）。普通饲料喂养，4周后处死。

1.4取材过程 细胞移植后4周，处死动物，取心脏标本。PBS液洗涤后，沿左室长轴断横切心脏，一部分用4%甲醛固定24 h，石蜡包埋，5μm切片，每块标本横断常规切片10张，用于免疫组化染色；其余部分放入冻存管立即置入液氮罐转移入-80℃冰箱冻存。

1.5逆转录多聚酶链反应（RT-PCR） 取心脏组织100 mg使用Trizol一步法提取细胞总RNA，继而将mRNA逆转录成cDNA，将目的基因Ang-1与内参β-actin按照预先设计好的引物进行扩增。Ang-1上游引物：5′-GGAGCATGTGATGGAAA ATTA-3′，Ang-1下游引物：5′-TGTGTTTTC CCTCCATTTCTA-3′，扩增产物长度：360bp。β-actin上游引物：5′- CTCTGGTC GTACCACT GGCATTG-3′；β-actin下游引物 5′- CCTG CTTGCTGATCCACATCTGC-3′。PCR扩增产物进行电泳，在Eagle Eye II凝胶成像分析仪上扫描定量，读取各PCR扩增带的积分光密度值（IOD），根据Ang-1条带和β-actin条带的IOD值比值分析其mRNA表达水平。

1.6免疫组化染色步骤 ① 石蜡切片脱蜡、水化，PBS洗2次，各5 min；② 蒸馏水或PBS配置新鲜的3% H2O2，室温封闭5～10 min，蒸馏水洗3次；③ 高温抗原修复，PBS洗5 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体；④滴加一抗（VIII因子抗体1：50，Ang-1 1：100，cTnT 1：50，MHC 1：50），室温1h或者4℃过夜（后在37°C复温45 min）；⑤ PBS洗3次每次2 min，滴加生物素化二抗（1：20），20～37℃ 20 min；⑥ PBS洗3次每次2 min，滴加试剂SABC，20～37℃ 20 min；⑦ PBS洗4次，每次5 min；⑧DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）；⑨蒸馏水洗、苏木素复染2 min、盐酸酒精分化；⑩脱水、透明、封片、镜检。

1.8统计学处理 所有数据分析均用SPSS 18.0软件包进行，组间比较采用方差分析和t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1人特异性心肌肌钙蛋白T（cTnT）和人主要组织相容性复合体（hMHC）免疫组化检测结果在移植组可见胞浆呈褐色的cTnT和hMHC阳性细胞，表明hUCBSC可在梗死区心肌内存活并分化为心肌细胞，而在对照组和假手术组标本内未见阳性移植细胞（图1、图2）。

图1　hMHC免疫组化染色（×400；A：移植组；B：对照组；C：假手术组）

图2　人特异性cTnT免疫组化染色（×400；A：移植组；B：对照组；C：假手术组）

2.2Ang-1 免疫组化检测结果 与假手术组比较，对照组和移植组Ang-1免疫组化染色积分光密度（IOD）值明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，移植组Ang-1免疫组化染色IOD值明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）（图3、表1）。

图3　Ang-1免疫组化染色（×400，A移植组，B对照组，C假手术组）

表1　三组Ang-1免疫组化结果比较

2.3Ang-1 RT-PCR检测结果 与假手术组比较，对照组和移植组Ang-1 mRNA的相对表达明显增加，同时与对照组相比，移植组Ang-1 mRNA相对表达也明显增加，差异有统计学意义（P均＜0.01）（图4、表2）。

2.4Ⅷ因子免疫组化染色结果 Ⅷ因子为心肌毛细血管密度测定指标，移植组梗死周边区毛细血管密度较对照组明显增加，而假手术组无明显变化（图5）。

图4　RT-PCR电泳结果

表2　三组移植4周后 Ang-1mRNA的相对表达水平

图5　Ⅷ因子免疫组化染色结果（×200；A：移植组；B：对照组；C：假手术组）

3　讨论

心脏干细胞移植治疗已成为目前心肌梗死治疗新的希望，但其相关机制尚不完全清楚。目前的研究结果认为可能有如下机制，①坏死心肌的修复和再生，2001年Orlic等［1］首次在Nature上报道了骨髓干细胞可以再生为心肌细胞；②再生血管改善灌注［8］；③血管活性物质的效应［9］。本研究证实了脐血干细胞移植能促进血管新生，但是血管新生过程中干细胞移植起到何种作用尚不明确。

器官和组织的血管生成包括两个过程：血管形成和血管新生。血管形成是成熟机体形成新生血管的唯一方式。研究表明血管生成素参与了血管生成过程，关于Ang-1的研究较多。Ang-1通过差异性剪接，可形成4种异构体，分子量分别为1.5 kD、1.3 kD、0.19 kD、017 kD。研究证明［10］1.3 kD和0.19 kD是Ang-1作用的负性调节因子，有下调Ang-1的作用。Ang-1含3个结构域［11］，其中第三结构域参与Ang-1和Tie2受体的结合［12］。Ang-1能与血管内皮细胞上的Tie2受体结合，具有维护血管结构的稳定和完整作用［13］。实验表明Ang-1基因敲除鼠血管结构简单、分支减少，由于心血管发育障碍，小鼠多死于胚胎发育早期。而转基因过表达Ang-1的新生小鼠皮肤血管比正常粗大，毛细血管、小静脉数量和分支增多，血管腔变大，内皮细胞与邻近的管周细胞、成纤维细胞间联系完整［14］。

本研究中Ang-1在移植组明显增加，可能与血管新生相关，提示hUCBSC移植能够通过分泌Ang-1的增加促进心肌梗死后血管新生，从而改善心脏功能。经静脉移植人脐血干细胞能在心肌梗死大鼠梗死心肌部位存活，并表达心肌特异性收缩蛋白，像心肌细胞样生存。

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本文编辑：姚雪莉

Effects of angiopoietin-1 on angiogenesis in umbilical cord blood stem cell transplantation in rats with myocardial infarction

ZHAO Rui-ping*， HAN Wei， LI Hong-yu， SUN Kai， HU Jiang.*Department of Cardiology， Central Hospital of Baotou City， Baotou 014040， China.

ZHAO Rui-ping， E-mail： 378839547@qq.com

Objective To discuss whether human umbilical cord blood stem cells （UCBSC） inducing angiogenesis through angiopoietin-1 （Ang-1） in rats with myocardial infarction after the transplantation of human UCBSC. Methods Male SD rats （n=40） were randomly divided into sham-operation group （n=9）， control group （n=11）and transplantation group （n=10）. The sham-operation group was only give treatment of chest-open without ligation of anterior descending coronary artery， control group was given intravenous injection of normal saline solution after the ligation for inducing myocardial infarction， and transplantation group was given intravenous injection of human UCBSC suspension after the ligation for inducing myocardial infarction. After 4 w， the rats were killed for collecting left ventricular tissues. The human-specific cardiac troponin T （cTnT）， human major histocompatibility complex （hMHC），VIII factor and Ang-1 were stained by using immunohistochemistry technique， and expression of Ang-1 mRNA was detected by using reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results There were positive cells of cTnT and hMHC with brown cytoplasma observed in transplantation group. Compared with sham-operation group，integral optical density （IOD） of Ang-1 increased significantly in control group and transplantation group （P＜0.05）. Compared with control group， IOD of Ang-1 increased significantly in transplantation group （P＜0.01）. Compared with sham-operation group， the expression of Ang-1 mRNA increased significantly in control group and transplantation group， and compared with control group， the expression of Ang-1 mRNA increased significantly in transplantation group （all P＜0.05）. VIII factor， as the index for detecting myocardial capillary density， increased significantly in transplantation group compared with control group， and had no significant changes in sham-operation group. Conclusion The intravenous transplanted human UCBSC can survive and express myocardial-specific contractile protein， and at the same time myocardial capillary density increases at cardiac infarction area in rats with myocardial infarction， and the mechanism maybe related to that the increase of Ang-1 expression can promote angiogenesis.

Stem cell； Angiopoietin-1； Angiopoietin-2； Myocardial infarction； Umbilical cord blood stem cells； Promoting angiogenesis

R541.4

A

1674-4055（2016）09-1046-04

内蒙古自然科学基金项目（2013MS1172）

1014040 包头，包头市中心医院心内科；2014040 包头，包头市中心医院影像科；3014040 包头，包头市中心医院普外科

赵瑞平，E-mail：378839547@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.09.07