糖尿病合并高血压大鼠瘦素和神经肽Y水平变化

李宝新，张云良，王君，周雪，梁璇璇，常文龙，郭淑芹

· 论著 ·

糖尿病合并高血压大鼠瘦素和神经肽Y水平变化

李宝新1，张云良1，王君1，周雪1，梁璇璇1，常文龙1，郭淑芹1

目的 探讨糖尿病合并高血压大鼠血清、下丘脑神经肽Y（NPY）和瘦素水平变化。方法 30只SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组、糖尿病合并高血压组，分别制作2型糖尿病模型和糖尿病合并高血压模型，各剔除1只。测定空腹血糖水平、血清NPY和瘦素水平，免疫组织化学法测定下丘脑瘦素和NPY表达情况。结果 与对照组比较，糖尿病组及糖尿病合并高血压组空腹血糖、瘦素和NPY水平均升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。糖尿病合并高血压组瘦素和NPY水平高于糖尿病组和对照组，数值为［（0.73±0.24）μg/L vs. （0.46±0.14）μg/L］、［（0.73±0.24）μg/L vs. （0.24±0.05）μg/L］，［（300.53 ±35.74）ng/L vs. （247.46±40.36）ng/L］、［（300.53±35.74）ng/L vs. （133.52±16.58）ng/L］，差异有统计学意义（P均＜0.05）。糖尿病组及糖尿病合并高血压组的瘦素和NPY表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。同时，糖尿病合并高血压组的下丘脑瘦素和NPY水平均高于糖尿病组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。糖尿病合并高血压组大鼠的血清瘦素和NPY水平呈正相关（r=0.952，P＜0.05）、下丘脑瘦素和NPY表达水平呈正相关（r=0.956，P＜0.05）。结论 糖尿病合并高血压大鼠血清、下丘脑瘦素和神经肽水平升高，代谢紊乱加重。

高血压；糖尿病；大鼠；神经肽Y；瘦素

糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，并发症多、预后差，目前缺乏完全治愈的方法。瘦素是由脂肪细胞合成和分泌，是一种能量平衡调节激素，可抑制食欲。下丘脑神经肽Y（NPY）经下丘脑弓状核分泌，是一种强烈的食欲刺激因子，参与摄食行为和能量消耗。研究显示，瘦素和NPY在2型糖尿病的发生和发展中起重要作用［1］。糖尿病引起高血压，而高血压又可加重糖尿病，二者相互影响。本研究旨在探讨糖尿病合并高血压大鼠血清、下丘脑NPY和瘦素的表达变化，以期了解代谢紊乱的相关机制。

1　材料与方法

1.1试剂和仪器 链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司，瘦素和NPY检测试剂盒购自河北博海生物工程开发公司，瘦素和NPY抗体购自北京中杉金桥公司。主要仪器：德国罗氏全自动化学发光分析仪，日本日立全自动生化分析仪，德国LEICA公司石蜡切片机等。

1.2动物分组及制模 雄性SD大鼠30只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，合格证号11400700150970，体重180～220 g，适应性饲养一周。随机分为3组：对照组、糖尿病组、糖尿病合并高血压组，每组各10只。2型糖尿病大鼠模型制备：给予高糖高脂饲料（普通饲料中加入20%蔗糖、15%熟猪油、2.5%胆固醇）8周，禁食12 h后腹腔注射STZ（0.1 mmol/L柠檬酸钠溶液配制，PH4.2），剂量为30 mg/kg。于实验第9周末选取尾静脉空腹血糖≥7.8 mmol/L，且伴有胰岛素抵抗者作为糖尿病动物模型［2］。糖尿病合并高血压大鼠模型制备：在糖尿病模型制备成功1周后，分离大鼠左肾动脉，将动脉缩窄30%～50%，2周后测量血压＞160 mmHg的作为糖尿病合并高血压大鼠模型［3］。对照组无任何干预措施。糖尿病组、糖尿病合并高血压组各有1只造模失败。

1.3瘦素和NPY水平测定 糖尿病、糖尿病合并高血压大鼠模型制备成功后，三组大鼠均空腹注射4%的水合氯醛麻醉，常规方法开腹，取腹主动脉血5 ml，经3000 r/min离心20 min，取上清液。采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖水平。采用放射免疫法应用瘦素和NPY检测试剂盒测定其水平。

1.4下丘脑NPY和瘦素的表达测定 ①标本制作：以0.9%生理盐水经心脏血管灌洗全脑，断头取脑，取下丘脑。经4%甲醛固定48 h后将组织修块，采用石蜡包埋，4 μm连续切片，室温放置30 min；②切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；③将组织切片浸泡于PH6.0的PBS缓冲液中，采用微波修复抗原30 min；④3%过氧化氢室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性；⑤加入抗体：Leptin兔多克隆抗体（1：200）、NPY兔多克隆抗体（1：250），4℃过夜后复温39 min，PBS冲洗3次，2 min/次；后加入生物素标记二抗（1：200），室温孵育30 min，PBS冲洗3次，2 min/次；⑥滴加SABC工作液，室温孵育30 min，PBS冲洗3次，2 min/次；⑦采用苏木素复染，后水洗5 min；⑧脱水晾干，透明树胶封片。结果判定：以胞质及胞核中出现棕黄色颗粒为阳性反应。免疫组织化学评分（HIS）参照文献［4］方法，应用IPP多功能真彩色细胞图像分析管理系统，每例标本在显微镜下随机选取5个高倍视野（× 400），结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面进行评分：a为阳性细胞百分比（无阳性细胞计0分，阳性细胞占1%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～80%计3分，81%～100%计4分）；b为阳性细胞染色强弱（阴性计0分，弱阳性计1分，中度阳性计2分，强阳性计3分），a、b两项乘积即为IHS评分。

1.4统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数的比较采用方差分析。相关性检验采取Person相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三组大鼠空腹血糖、瘦素和NPY水平比较 与对照组比较，糖尿病组及糖尿病合并高血压组空腹血糖、瘦素和NPY水平均升高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。糖尿病合并高血压组瘦素和NPY水平高于糖尿病组和对照组的数值为［（0.73 ±0.24）μg/L vs. （0.46±0.14）μg/L］、［（0.73± 0.24）μg/L vs. （0.24±0.05）μg/L］，［（300.53± 35.74）ng/L vs. （247.46±40.36）ng/L］、［（300.53 ±35.74）ng/L vs. （133.52±16.58）ng/L］，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

2.2三组大鼠下丘脑瘦素和NPY表达比较 糖尿病组及糖尿病合并高血压组的瘦素和NPY表达水平均高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。同时，糖尿病合并高血压组的下丘脑瘦素和NPY水平均高于糖尿病组，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表2、图1、图2）。

2.3糖尿病合并高血压大鼠瘦素与NPY的相关性分析 糖尿病合并高血压组大鼠的血清瘦素和NPY水平呈正相关（r=0.952，P＜0.05）、下丘脑瘦素和NPY表达水平呈正相关（r=0.956，P＜0.05）。

3　讨论

表1　三组大鼠空腹血糖、瘦素和NPY水平比较

近年来，我国的糖尿病发病率逐渐升高，且呈现年轻化趋势。糖尿病患者常伴水、蛋白质及脂肪代谢紊乱，是高血压发病的重要危险因素。糖尿病合并高血压的患者心肌梗死、脑卒中的发病几率比正常人高4～8倍。脂肪细胞对能量代谢有重要调节作用，其分泌的激素和生物活性因子在糖尿病、高血压的发生和发展中扮演重要的角色，如瘦素、脂联素、肿瘤坏死因子等。

表2　三组大鼠下丘脑瘦素和NPY的表达水平比较（分）

图1　三组大鼠下丘脑瘦素的表达情况（×400；免疫组化；A：对照组；B：糖尿病组；C：糖尿病合并高血压组）

图2　三组大鼠下丘脑NPY的表达情况（×400；免疫组化；A：对照组；B：糖尿病组；C：糖尿病合并高血压组

瘦素是一种脂肪细胞分泌的脂源性内分泌多肽激素，参与调控机体摄食、体温、能量平衡，与胰岛素之间存在双向调节［5］。正常情况下，瘦素调节摄食行为和能量平衡。病理情况下，机体出现瘦素抵抗，瘦素对胰岛素的抑制作用减弱，摄食量增加，血糖水平升高。研究显示［6］，瘦素的异常分泌是2型糖尿病发病的前兆。而且瘦素参与机体能量的调节可能是通过下丘脑NPY实现的。NPY是由下丘脑弓状核神经元合成和分泌，是一种很强的食欲刺激因子，在神经内分泌中起神经调质作用［7］。正常情况下，NPY升高一方面增加食欲，另一方面增加体内脂肪含量，使体重增加。瘦素可与NPY神经元上的瘦素受体结合，抑制NPY分泌，二者形成瘦素-下丘脑NPY轴，参与摄食，影响糖脂代谢［8］。当垂体受损时，瘦素和NPY出现转运障碍，从而出现碳水化合物代谢异常［9］。糖尿病的发病可能与NPY和瘦素有关，但血压对糖尿病NPY和瘦素的影响目前未见报道。

本研究结果显示，糖尿病合并高血压大鼠血清瘦素和NPY水平、下丘脑瘦素和NPY蛋白表达水平均高于糖尿病组，说明高血压改变了原有糖尿病瘦素和NPY的水平。有动物实验发现［10］，瘦素是自发性高血压大鼠的血管平滑肌细胞的增殖因子，增加血管阻力，可导致动脉粥样硬化的发生。糖尿病合并高血压大鼠胰岛素抵抗进一步加重，加重病情。其可能的机制是瘦素的下游信号出现障碍，抑制了NPY神经元，导致下丘脑NPY水平上调。总之，合并高血压可增加糖尿病大鼠的瘦素和NPY水平，加重代谢紊乱，瘦素和NPY两者之间呈正相关，这为防治糖尿病患者出现高血压提供了依据。

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本文编辑：姚雪莉

Changes of Neuropeptide Y （NPY） and leptin in rats with diabetes complicated with hypertension

LI Bao-xin*， ZHANG Yun-liang， WANG Jun， ZHOU Xue， LIANG Xuan-xuan， CHANG Wen-long， GUO Shu-qin.*Department of Endocrinology， First Central Hospital of Baoding City， Baoding 071000， China.

GUO Shu-qin， E-mail： nfmgsq@sina.com

Objective To discuss the changes of serum and hypothalamus Neuropeptide Y （NPY） and leptin in rats with diabetes complicated with hypertension. Methods SD rats （n=30） were randomly divided into control group， diabetes group and diabetes+hypertension group， and model of type 2 diabetes mellitus and model of diabetes+hypertension were established. The levels of fasting plasma glucose， serum NPY were detected，and expressions of hypothalamus leptin and NPY were detected by using immunohistochemistry technique. Results Compared with control group， the levels of FPG， leptin and NPY increased in diabetes group and diabetes+hypertension group （all P＜0.05）. The levels of leptin and NPY were higher in diabetes+hypertension group than those in diabetes group and control group ［（0.73±0.24） μg/L vs. （0.46±0.14） μg/L］， ［（0.73±0.24） μg/L vs.（0.24±0.05） μg/L］， ［（300.53±35.74） ng/L vs. （247.46±40.36） ng/L］， ［（300.53±35.74） ng/L vs. （133.52±16.58）ng/L， all P＜0.05］. The expressions of leptin and NPY were higher in diabetes group and diabetes+hypertension group than those in control group （all P＜0.05）. At the same time， the levels of hypothalamus leptin and NPY were higher in diabetes+hypertension group than those in diabetes group （all P＜0.05）. The level of serum leptin was positively correlated to level of serum NPY （r=0.952， P＜0.05）， and expression of hypothalamus leptin was positively correlated to expression of hypothalamus NPY （r=0.956， P＜0.05） in diabetes+hypertension group. Conclusion The levels of serum and hypothalamus leptin and NPY increase and metabolic disorder is severer in rats with diabetes complicated with hypertension.

Hypertension； Diabetes； Rats； Neuropeptide Y； Leptin

R544.1

A

1674-4055（2016）09-1040-03

国家自然科学基金面上项目（81500644）

1071000 保定，保定市第一中心医院内分泌科

郭淑芹，E-mail：nfmgsq@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.09.05