DSS调节内脂素防治去卵巢大鼠骨基质丢失的研究*

黎　晓，曾雪亮， 黄志华，刘瑞珍，葛程焜，肖　海

(1.赣南医学院；2.赣南医学院第一附属医院，江西　赣州　341000)



DSS调节内脂素防治去卵巢大鼠骨基质丢失的研究*

黎晓1，曾雪亮2， 黄志华1，刘瑞珍1，葛程焜1，肖海1

(1.赣南医学院；2.赣南医学院第一附属医院，江西赣州341000)

目的:探讨 3'-大豆苷元磺酸钠(3 '-daidzein sulfonate sodium, DSS)调节内脂素防治去卵巢大鼠骨基质丢失的作用。方法：选择清洁级SD雌性大鼠60只，体重160～220 g，随机分成5组:①假手术组(正常对照组)，②卵巢切除组(模型组)，③卵巢切除+戊酸雌二醇组(阳性药物对照组)，④卵巢切除+DSS高剂量组(100 μg·kg-1)，⑤卵巢切除+DSS低剂量组(30 μg·kg-1)。术后1周连续阴道涂片检查10天后，①②组大鼠每天灌胃同体积生理盐水；③组大鼠每天一次戊酸雌二醇片剂水溶悬液灌胃，剂量为80 mg·kg-1；④⑤组分别以高、低剂量的DSS溶液灌胃，1次·d-1。连续给药8周。大鼠禁食12 h，麻醉后腹主动脉取血并分离血清，严格按照试剂盒说明，用ELISA方法检测血清中内脂素(Visfatin)的含量，化学比色法测定血清中STrACP含量。另取实验大鼠右股骨，以浓硝酸消化后火焰原子吸收光谱法检测骨钙、骨镁浓度。结果：与模型组比较，DSS可升高骨钙、骨镁浓度，降低血清内Visfatin及STrACP含量，差异有统计学意义。结论：DSS可能通过调节内脂素预防大鼠去卵巢后因雌激素缺乏所致的骨基质丢失，其作用机制可能通过调节内脂素的联动效应达到维持大鼠骨代谢平衡。

3'-大豆苷元磺酸钠；内脂素；绝经后骨质疏松症

随着经济发展、人们生活方式的改变以及人口老龄化的出现，骨质疏松症的发病率逐年上升，围绝经期妇女因容易出现程度不同的低雌激素血症而表现突出[1-2]。大豆苷元(daidzein,DD)是大豆异黄酮的一种，具有类雌激素样作用。很多研究证实大豆苷元能够促进骨代谢，抑制骨转化[3-5]，防止大鼠牙周骨骨质丢失[6]，然而却因难溶于水在临床应用中受到限制。因此，本课题组与沈阳药科大学合作，对大豆苷元进行结构修饰和改性后得到了新的强水溶性物质，即3'-大豆苷元磺酸钠(3'-daidzein sulfonate sodium,DSS)，化学式为:C15H9O7SNa。DSS是强酸强碱水溶性盐，具有生物利用度高、服用量较小、显效快等优点。课题组前期研究发现，DSS对去卵巢大鼠的骨代谢与脂代谢均有一定调节作用[7-8]，本研究拟进一步探讨DSS是否可以防治去卵巢大鼠骨基质主要成分钙与镁的丢失，并初步研究其防治机制是否与调节内脂素的联动效应有关，进而维系骨健康。

1　材料与方法

1.1试验药物3'-大豆苷元磺酸钠由沈阳药科大学中医药学院植化教研室提供，实验前用超纯水溶解成300 μg·kg-1的混悬液，按实验需要用双蒸水稀释至所需浓度。

1.2试剂抗酒石酸酸性磷酸酶(Startrate resistant acid phosphatase),STrACP试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Visfatin ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，戊酸雌二醇由拜耳公司生产，生产批号030A。

1.3仪器日立7060全自动生化分析仪，赛多利斯BS224S型电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，XB100KS型制冰机(宁波格兰特制冷设备制造有限公司)，MDF-U4186S超低温冰箱(日本三洋)，MK3型酶标仪(美国Thermo)，TAS-990原子吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

1.4动物SD大鼠购自江西中医学院实验动物中心，体重160～220 g，雌性(动物中心许可证号：2007-0001，动物合格证号：JZDW2007-076，级别：清洁级)，每日均给予普通全价饲料喂养，饮水为自来水，自由饮食。

1.5方法

1.5.1卵巢切除术(1)手术前，大鼠禁食24 h，饮水不限。用10%水合氯醛(0.35 mL·100 g-1)腹腔注射麻醉后，将大鼠固定，剪去腹部毛，外科常规消毒，在耻骨联合上1 cm处正中切开皮肤、筋膜和腹膜，打开腹腔，切口大约1 cm，在视野中可见一乳白色发亮的脂肪团，将脂肪团拉出，在其末端可见一簇囊泡状的粉红色组织即为卵巢，剪取时，先将卵巢下输卵管(包括脂肪)用丝线结扎，再摘除卵巢，术后顺势将子宫角送回腹腔中。同法摘除另一侧卵巢，待卵巢摘除完全后，关闭腹腔，并消毒置于干净的大鼠鼠笼里。(2)假性卵巢切除术:方法同(1)。但不同的是:找到卵巢后并不切除，而将其拉到切口外暴露后，然后重新放回腹腔内。

1.5.2实验分组健康SD雌性大鼠60只，体重160～220 g，随机分成5组:①假手术组(正常对照组)、②卵巢切除组(模型组)、③卵巢切除+戊酸雌二醇(阳性药物对照组)、④卵巢切除+DSS高剂量组、⑤卵巢切除+DSS低剂量组。术后1周连续阴道涂片检查10天后，①②组大鼠每天同体积生理盐水灌胃；③组大鼠戊酸雌二醇片剂水溶悬液灌胃，剂量为80 mg·kg-1·d-1，其余时间每天同体积生理盐水灌胃；④⑤组分别以高、低剂量的DSS溶液灌胃，1 次·d-1。连续给药8周，进行以下实验。

1.5.3各指标的检测

1.5.3.1DSS对去卵巢大鼠血清中STrACP含量的影响大鼠麻醉后腹主动脉取血，3 500 r·min-1，离心10 min，分离血清，化学比色法测定血清中STrACP的含量。

1.5.3.2DSS对去卵巢大鼠血清中Visfatin水平的影响以上方法分离血清后用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中Visfatin水平。

1.5.3.3DSS对去卵巢大鼠股骨中钙、镁含量的影响大鼠采血完毕取右侧股骨，剔除表面结缔组织，电子天平称重后用浓硝酸充分消化，经火焰原子吸收光谱法检测股骨钙、镁的浓度。

2　结　果

2.1DSS对去卵巢大鼠股骨中钙、镁含量的影响与模型组比较，DSS可明显升高股骨中钙、镁含量，差异有统计学意义，提示DSS可有效对抗大鼠去卵巢后因雌激素缺乏所致的骨基质丢失(见图1，2)。

2.2DSS对去卵巢大鼠血清中STrACP浓度的影响结果显示，与模型组比较，DSS可明显降低血清中STrACP含量，差异有统计学意义，提示DSS可能通过调节STrACP活性发挥对骨吸收与骨形成的调节作用，从而维持骨代谢平衡(见图3)。

2.3DSS对去卵巢大鼠血清内脂素(Visfatin)水平的影响ELISA方法检测血清中脂联素(Visfatin)浓度，结果表明，与模型组比较，各给药组Visfatin浓度均降低，差异有统计学意义，说明DSS能调节Visfatin浓度对抗大鼠因雌激素缺乏引起脂肪因子分泌异常所致的代谢异常(见图4)。

图1骨钙含量

图2　骨镁含量

图3血清中STrACP含量

图4　血清中内脂素的含量

3　讨　论

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)是指绝经后妇女由于卵巢功能低下，雌激素明显减少，出现骨偶联过程失衡，即骨吸收作用超过了骨形成作用，导致净骨量减少，骨强度降低，骨脆性增加，易于发生骨折的代谢性骨疾病。

临床发现，骨质疏松症与骨量减少患者常合并有脂代谢障碍，且骨质疏松症经治疗改善后，脂代谢障碍也往往得以逆转，提示脂代谢可能与PMOP的发病存在一定关系。近年研究发现[9]，脂肪组织是重要的内分泌器官，可分泌包括脂联素、内脂素等多种细胞因子，这些细胞因子不仅参与了糖、脂代谢、胰岛素敏感性、心血管功能等多种生理过程的调节，而且对骨代谢的调节也具有重要作用[10]。其中内脂素是2005年发现的一种特异性表达于内脏脂肪的脂肪因子，它可增加Ⅰ型胶原表达，提高成骨细胞分化与矿化，同时抑制破骨细胞产生，对骨代谢的调节具有积极影响。Li等[11]研究发现，内脂素抑制剂FK866可降低骨髓间充质干细胞的矿化，减少骨形成。Moschen等[12]研究还发现，内脂素可抑制前体破骨细胞向抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞分化，抑制破骨细胞生成。另有研究称[13]，PMOP患者血清中内脂素水平高于骨量减少患者，且骨密度值与血清内脂素水平成负相关，而与骨吸收指标STrACP成正相关，说明血清内脂素水平异常表达可能具有加快骨吸收、影响骨代谢的作用，并由此影响PMOP的发病。

STrACP参与骨基质中Ca、Mg、P矿化底物的降解及骨吸收窝陷的形成，由此被认为其直接参与了破骨细胞骨吸收过程[14]。 由破骨细胞产生的STrACP可进入血液循环，故检测血清中STrACP的水平可以反映体内破骨细胞活性和骨吸收状态。而Ca和Mg是骨骼的主要构成元素，骨代谢其实就是机体内Ca、Mg和P的代谢，即骨组织不断地将储存的Ca、Mg和P释放入血，使血Ca、Mg和P含量升高，同时又将血中Ca、Mg和P回存于骨骼中，以保证骨矿代谢的稳态[15]。Ca、Mg和P的过度丢失和吸收不佳会致使骨代谢失调，引起骨质疏松。

本实验采用去卵巢大鼠模型，模拟妇女绝经后对药物干预的反应，结果表明，各DSS治疗组大鼠血清内Visfatin和STrACP水平明显降低，差异有统计学意义，说明DSS能有效对抗去卵巢大鼠因雌激素降低引起的脂肪因子Visfatin的释放，启动一系列骨代谢与脂代谢的平衡调节效应，并有效降低血清STrACP水平，抑制骨吸收的过度，促进骨形成的正向趋势；同时，DSS能有效稳固去卵巢大鼠股骨中钙和镁的含量，差异有统计学意义，对于防止骨基质丢失有积极作用。上述结果进一步提示，DSS可能通过调节血清内脂素水平，活化机体内骨代谢与脂代谢的调节平衡体系，进而降低血清内STrACP水平，抑制骨吸收过程，促进骨形成，达到骨代谢平衡状态，减少因雌激素减少而致的骨质疏松症发生。并且，本实验干预药物DSS为强水溶性的类雌激素物质，生物利用度高，毒副作用小或无。与阳性药物戊酸雌二醇对照组比较，DSS维持去卵巢大鼠股骨中镁的含量以及降低血清中Visfatin水平的效果均更佳，其作为雌激素替代药物的开发有一定实际意义。因此，本研究结果可能为探索防治骨质疏松症雌激素替代药物的开发提供实验依据。

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DSS Sustains Bone Matrix of Ovariectomized Rats by Regulating Visfatin

LIXiao1,ZENGXue-liang2,HUANGZhi-hua1,LIURui-zhen1,GECheng-kun1,XIAOHai1

(1.GannanMedicalUniversity;2.TheFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity，GanzhouJiangxi341000)

Objective:To study the effect of 3 '-daidzein sulfonate sodium (DSS) on sustaining the bone matrix of ovariectomized rats. Methods: Sixty SD female rats with weight between 160～220 g were randomly divided into 5 groups: ①sham group (control group); ②ovariectomy group (model group); ③ovariectomy+estradiol valerate treatment group (positive control group); ④ovariectomy+high-dose DSS (100 μg·kg-1); ⑤ ovariectomy + low-dose DSS(30 μg·kg-1). Vaginal smear was examined consecutively for 10 days one week after surgery. ①②Group were gavaged with the same volume saline; ③group were gavaged with estradiol valerate solution (80 mg·kg-1) once per day;④⑤group were gavaged with high-and low-dose DSS solution once per day. All the rats were gavaged for 8 weeks and starved for 12 hours before anesthesia. Abdominal aortic blood was taken from anesthetized rats and serum was isolated to measure visfalin level using ELISA kit. The serum STrACP level was also assessed by chemical colorimetric method. The right femur was excised, and digested with concentrated nitric acid for bone calcium and magnesium measurement using the flame atom absorption method. Results:DSS treatment increased the level of bone calcium and magnesium, and reduced the concentration of visfatin and STrACP. The comparison between the model group and DSS treatment groups was statistically significant. Conclusion:DSS can regulate visfatin to prevent the loss of bone matrix caused by estrogen insufficiency post ovariectomy. A possible mechanism for this effect might rely on the coupling effect of visfatin regulation to maintain the osseous homeostasis．

3 '-daidzein sulfonate sodium; Visfatin; Postmenopausal osteoporosis

国家自然科学基金项目(No. 81560583)；江西省自然科学基金项目(No.20142BAB205021)；

黄志华，女，教授，博士，主要从事心脑血管方向研究。E-mail:18970786003@163.com

肖海，男，副教授，硕士，主要从事心脑血管方向研究。E-mail:xh669168@sina.com

R285.5

A

1001-5779(2016)03-0339-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.002

2016-02-03)(责任编辑：敖慧斌)

江西省卫计委科技项目(No.20092087)