LC-MS/MS法测定赣江水中微囊藻毒素的初步研究*

林　芬,邱　伟,刘艳红,李舒梅,刘大娇, 程文炜,詹晓民

(赣南医学院　1.预防医学系；2.2010级预防医学专业，江西　赣州　341000)



LC-MS/MS法测定赣江水中微囊藻毒素的初步研究*

林芬1,邱伟1,刘艳红1,李舒梅1,刘大娇2, 程文炜2,詹晓民2

(赣南医学院1.预防医学系；2.2010级预防医学专业，江西赣州341000)

目的:建立微囊藻毒素(MC-LR，MC-RR和MC-YR)的固相萃取-高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析方法，测定赣江水中微囊藻毒素含量。方法：采集赣江水样18份，通过固相萃取柱富集净化，在电喷雾正离子模式下，以多反应监测模式采集数据，对微囊藻毒素进行定性与定量分析。结果：方法的线性范围为1.0～20 μg·L-1，线性相关系数0.999 8～0.999 9，检出限量为20 ng·L-1，平均回收率为66%～88.73%；相对标准偏差(RSD)为4.11%～12.78%。18份水样中均未检出微囊藻毒素，达到《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)。结论：该方法用来测定水中微囊藻毒素，操作快速简单、干扰少、准确；由于微囊藻毒素受采样时间、光照和气温等因素的影响，应持续监测水样，以保证赣江水质符合标准。

LC-MS/MS；微囊藻毒素；赣江

微囊藻毒素(Microcystins，Mcs)是由水体中蓝绿藻如铜绿微囊藻、鱼腥藻等产生的一类具有生物活性的单环七肽化合物，其中MC-LR、MC-RR和MC-YR是分布最广，毒性最大的三种微囊藻毒素[1]。赣江是江西省的重要水源，随着经济的迅速发展，工厂数量急剧增加，农业和生活用水大量排放使水中的氮磷等有机污染物含量增加，水体富营养化，造成藻类滋生，微囊藻毒素也随之增加。为了解赣江及鄱阳湖微囊藻毒素的污染状况，我们采用特异性和灵敏度高的三重四级杆高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定赣江水中微囊藻毒素的含量，以期为江西省相关管理部门提供理论依据和决策参考。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂安捷伦1260型快速高分离液相色谱仪和6420型三重四级杆串联质谱仪，配有ESI大气压电喷雾源，工作站为Agilent Mass Hunter B.06.00；色谱柱：C18反相柱，柱长50 mm，内径4.6 mm，填料粒径1.8 μm(美国安捷伦有限公司)；固相萃取装置(美国SUPELCO 公司)；氮吹仪(美国Organomation Associates 公司);微囊藻毒素标准品(MC-LR、MC-RR、MC-YR) 混标，5 μg·mL-1(美国Sigma 公司)；甲酸:色谱纯(上海阿拉丁公司)；甲醇、乙腈均为色谱纯(美国TEDIE公司)；实验用水为二次蒸馏超纯水；氮气(纯度大于99.999%)。

1.2水样采集、前处理

1.2.1采样点的布设及采集根据赣江的特点，于2015年4月分别在赣江入口前的章江、贡江、赣江起始段以及赣江途经的万安段、吉安段、南昌段进行采样，每个采样点分别采集3份水样，每份水样采集2 L，记录采样时间、地点、天气、水温及pH，并填写采样记录单。

1.2.2水样的前处理[2]将采集来的水样用500目的不锈钢筛过滤，除去水中的悬浮物和一些浮游生物。再取过滤后的水样1 100 mL于玻璃杯式滤器中，先用47 mm GF-C玻璃纤维滤膜减压过滤两次，0.45 μm乙酸纤维酯滤膜减压过滤一次，准确量取1 000 mL于棕色玻璃瓶中。

1.2.3样品的制备[2]将依次用10 mL甲醇和15 mL纯水活化的C18固相萃取小柱连接到SPE固相萃取装置，将1 000 mL水样流经固相萃取小柱，控制流速为5 mL·min-1，对水样进行富集。再依次用10 mL纯水及10 mL 20%的甲醇淋洗小柱，10 mL酸化甲醇进行洗脱，洗脱液在氮吹仪上吹至尽干，残留物用1mL流动相，涡旋混合，经0.22 μm有机滤膜过滤后，上机待测。

1.3实验条件

1.3.1色谱条件色谱柱：Agilent zorbax Eclipse XDB-C18，2.1×50 mm，填料粒径为1.8 μm；柱温：25 ℃；流动相A为含0.1%的甲酸水溶液，流动相B为含0.1%的甲酸乙腈溶液；流动相A∶B=60∶40；流动相流速：0.3 mL·min-1；进样体积为10 μL；采用外标法定量。

1.3.2质谱条件离子源：大气压电喷雾离子源(ESI)，采用正离子检测模式；干燥气流速：11 L·min-1；干燥气温度：350 ℃；雾化气压力：35 psi；毛细管电压：4 000 V；采用多反应离子监测模式(MRM)，分别确定三种微囊藻毒素的保留时间、定量离子对、定性离子对、驻留时间、源内裂解电压、定量离子对碰撞池电压、定性离子对碰撞池电压，见表1。

表1　微囊藻毒素-LR的质谱参数

2　结　果

2.1线性范围、检出限、精密度、加标回收率三种微囊藻毒多反应检测色谱图见图1～3，将MC-LR，YR，RR的标准溶液，稀释浓度分别为1.0、2.5、5.0、10、20 μg·L-1，将所得的峰面积值Y与浓度X进行线性回归分析，得到标准曲线，见表2，回归系数R2>0.999 8，线性较好。

取空白水样，分别添加2个浓度水平的3种微囊藻毒素混合标准工作液，每个添加浓度重复6次，计算添加回收率和测定结果的相对标准偏差。水中3种微囊藻毒素的平均回收率为66%～88.73%(表3)；

图1　微囊藻毒素-RR MRM色谱图

图2　微囊藻毒素-YR MRM色谱图

图3　微囊藻毒素-LR MRM色谱图

微囊藻毒素标准曲线相关系数R2MC⁃LRy=989．497727X+19．4537030．9999MC⁃RRy=56．753X+186．430．9998MC⁃YRy=5844．1X-12．750．9998

相对标准偏差(RSD)为4.11%～12.78%。检出限是依据微囊藻毒素标准溶液的信噪比(S/N)为10的条件得出，本法最低检测限为20 ng·L-1，低于GB/T20466-2006[2]高效液相色谱法的0.1 μg·L-1。由此可见，LC-MS/MS法测定微囊藻毒素，灵敏度及特异度均高，符合国家要求。

表3　不同加标水平下3种微囊藻毒素的回收率和精密度/n=6

2.2样品中微囊藻毒素的检测水样取自2015年4月的赣江及鄱阳湖10个采样点章江、贡江、赣江起始段、吉安市万安县、吉安市青原区、南昌新建县10个地区进行采样，每个采样点3份水样，这18个实际样品采用优化后的实验条件进行检测，检测结果见表4。由表可见6个采样点采集的18个水样中均未检测出微囊藻毒素LR，YR，RR。

表4　赣江水样中微囊藻毒素检出情况

注：ND代表未检出。

3　讨　论

3.1质谱条件的优化三重四极杆串联质谱能够进行多反应离子监测，最大程度上减小基质的干扰，为目标化合物的分析提供高选择性和高灵敏度[3]。在全扫描的模式下，注射标准溶液找到三种微囊藻毒素的母离子(precursor ion)，在选择性离子监测(SIM)模式下，找到优化的源内裂解电压，在产物离子扫描(product ion scan)模式，找到特征子离子(pmduct ion)，确定离子对(transition)，在MRM模式下，找到每个确定离子对优化的CE。LC-MS/MS法能够满足水中微囊藻毒素的检测要求[4]。

3.2结果分析WHO规定饮用水中微囊藻毒素MC-LR 的限量值为1 μg·L-1[5]。我国《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)[6]及《地表水环境质量标准》(GB 3838-2002)[7]中将MC-LR 的标准限值定为1 μg ·L-1。由于微囊藻毒素受到采样时间、光照和气温等因素的影响，具有时间上和空间上的局限性。一般认为微囊藻毒素浓度从高到低的季节性分布总体表现是夏秋季(6～11月)>春季(3～5月)>冬季(12月、1月、2月)，而本次采样时间为4月份，采集的水样中均未检测到微囊藻毒素，这有可能与采样期间水体中MC浓度比较低有关；其次是4月份雨水多，采样点水量充足，对微囊藻毒素存在着一定的稀释作用，因此只在丰水期采一次样是不足以反映水中微囊藻毒素污染情况的，应该根据我国《水环境监测规范》对具有向城市供水功能的水库或者湖泊，每月各采样 1次，分别要采集到丰水期、枯水期、平水期的水样，在水华特别严重的夏秋季节应加强监测力度，增加采集频数[8]，才能真正说明水中微囊藻毒素的含量。

虽然此次调查各个采样点均未检测出微囊藻毒素，但是尚不能肯定赣江未受到微囊藻毒素污染，建议在监测水中微囊藻毒素的三个主要异构体(MC-LR、MC-RR、MC-YR)的同时，对水体富营养化进行评价。此外对赣江及鄱阳湖的水都应进行长期系统的监测，以期更加准确有效的评价两大水体中微囊藻毒素污染状况，为保护人民群众的身心健康提供科学的依据。

[1]DAWSON R M. The toxicology of microcystins[J].Toxicon,1998,36(7): 953-962.[2]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会．GB/T20466-2006中华人民共和国国家标准-水中微囊藻毒素的测定[S]．北京: 中国标准出版社，2006.

[3]WHO. Guidelines for drinking water quality[M].Third edition.Geneva:World Health Organization,2004:407-408.

[4]Amanda J Foss, Aubel Mark T.Using the MMPB technique to confirm microcystin concentrations in water measured by ELISA and HPLC (UV, MS, MS/MS)[J].Toxicon,2015,104:91-101.

[5]栾伟. 液相色谱串联质谱法分析饮用水中微囊藻毒素[J].中华预防医学杂志，2008，42(5):359-360.

[6]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会．GB 5749-2006中华人民共和国国家标准-生活饮用水卫生标准[S]．北京: 中国标准出版社，2006.

[7]国家环境保护总局，国家质量监督检验检疫总局.GB3838-2002中华人民共和国国家标准-地表水环境质量标准[S]．北京: 中国标准出版社，2002.

[8]庄一廷.湖库型饮用水源地富营养化污染控制研究[J].海峡科学，2007，6:77-79.

The Preliminary Study on the Determination of Three Microcystins in the Ganjiang River by HPLC-MS /MS

LINFen1,QIUWei1,LIUYan-hong1,LIShu-mei1,LIUDa-jiao1,CHENGWen-wei2,ZHANXiao-min2

(1.Dept.ofPreventiveMedicine;2.2010-gradePreventiveMedicineMajorofGannanMedicalUniversity,GanzhouJiangxi341000)

Objective: A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric was established for the determination of three microcystins (MC-LR，MC-RR,MC-YR) in the Ganjiang River.Methods: Eighteen samples from the Ganjiang River were enriched and purified by solid phase extraction column, then detected by a high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer. The identification was achieved by electrospray ionization (ESI) in positive mode using multiple reaction monitoring. Results: The calibration curves of three microcystins showed good linearity in the range of 1～20 μg·L-1, with correlation coefficient in the range of 0.999 8～0.999 99．The detection limit of the method was 20 ng·L-1. The recovery of two spiking levels ranged from 66% to 88.73%，and RSDs ranged from 4. 11% to 12.78%．Microcystins were not detected in 18 samples of the Ganjiang River, showing that the water quality reached "Sanitary Standards for Drinking Water". Conclusion: The method for the determination of microcystins of the Ganjiang River by HPLC-MS /MS was of operation convenience, less interference from impurities and good accuracy. The levels of Microcystins were influenced by sampling time, illumination, and temperature. Therefore, microcystins should be monitored in order to ensure the water quality of the Ganjiang River.

LC-MS /MS;Microcystin;The Ganjiang River

江西省教育厅科技项目，赣教技字[2006]254号；江西省教育厅科技项目(NO：GJJ11209)；赣州市科技局课题，赣市科发[2005]20号，赣市财教字[2005]33号

李舒梅，女，教授，硕士生导师。E-mail:gnyxylsm@163.com

R123.1

A

1001-5779(2016)03-0347-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.004

2015-10-14)(责任编辑：刘仰斌)