miR-155调控Wnt/β-catenin信号通路与IgAN肾小管间质纤维化的关系*

叶伟标，李　仪，刘　涛，王　珍，李仲均，黄素然

(1.南方医科大学附属东莞人民医院，广东　东莞　523059；2.广东省人民医院，广东　广州　510080)



miR-155调控Wnt/β-catenin信号通路与IgAN肾小管间质纤维化的关系*

叶伟标1，李仪1，刘涛2，王珍1，李仲均1，黄素然1

(1.南方医科大学附属东莞人民医院，广东东莞523059；2.广东省人民医院，广东广州510080)

目的:检测miR-155在IgA肾病(IgAN)中的表达，探讨其与患者临床病理参数的相关性及可能作用机制。方法:应用实时荧光定量PCR检测肾活检组织中miR-155的表达水平；利用脂质体介导miR-155 mimics瞬时转染人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)，通过RT-PCR和Western blot检测β-catenin、snail、fibronectin、E-cadherin的表达情况。结果:miR-155在IgAN组肾活检组织中的表达水平显著高于对照组(P<0.01)；肾活检组织中miR-155表达量与肾小管间质纤维化呈正相关关系，与肾小球滤过率呈负相关关系；体外细胞实验显示，上调miR-155表达可激活Wnt/β-catenin信号通路，间质表型标志物fibronectin表达升高，而上皮表型标志物E-cadherin表达下降。结论:miR-155的表达上调与IgAN肾小管间质纤维化密切相关，其可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路参与IgAN的进展。

miR-155；Wnt/β-catenin；IgA肾病；肾小管间质纤维化

IgA肾病(IgA nephropathy, IgAN)是我国最常见的肾小球疾病之一。根据肾活检统计数据显示，IgAN约占原发性肾小球肾炎的45.3%～54.3%[1]。IgAN的临床表现、治疗反应和预后均存在较大的个体差异，临床上约有30%～50%的患者在确诊后的5～25年内进展为终末期肾脏病，给家庭和社会造成沉重的负担。肾小管间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾脏病的共同通路。因此，研究IgAN肾小管间质纤维化的发生机制具有重要的现实意义。microRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的内源性非编码单链小分子RNA，可通过与靶mRNA互补结合，对靶基因进行转录后调控。近年的研究发现，miRNA在细胞分化、免疫应答、炎症反应等多种病理生理过程中起重要作用。miR-155在IgAN中的表达及其作用尚未明确。本研究采用实时荧光定量RT-PCR检测IgAN肾活检组织中miR-155的表达情况；通过转染miR-155模拟物，观察miR-155对人肾近曲小管上皮细胞株Wnt/β-catenin信号通路及下游基因表达的影响，探讨miR-155在参与IgAN肾小管间质纤维化中的可能机制。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1临床标本选取2014年6月至2015年6月期间在南方医科大学附属东莞人民医院肾内科住院并经临床和肾活检确诊为原发性IgAN患者37例，收集肾活检石蜡存档标本。入选的病例均已排除系统性红斑狼疮、过敏性紫癜、乙型肝炎病毒相关性肾炎等继发性IgAN。选取因肾肿瘤行肾切除术患者16例，用18号穿刺针留取距离肿瘤>2 cm处的肾组织作为正常对照。

1.1.2细胞株人肾近曲小管上皮细胞系HK-2购自中国科学院细胞库。

1.2方法

1.2.1资料收集及病理评估收集患者年龄、性别、体重、血压、24小时尿蛋白定量(UPE)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)等临床资料。采用改良简化MDRD方程[2]计算肾小球滤过率(eGFR)。肾活检组织经固定及包埋切片后常规行光镜、免疫荧光和电镜检查。参照文献报道的方法[3]，对肾小管间质纤维化程度进行量化评估。

1.2.2miR-155表达水平的检测石蜡包埋肾穿刺组织5 μm厚度切片5张，使用miRNeasy FFPE Kit(Qiagen)提取并纯化miRNA。应用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit (TIANGEN)将miRNA逆转录为cDNA；使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit(TIANGEN)进行实时定量PCR。miR-155上游引物序列为5’-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3’；U6上游引物序列为5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’。PCR反应条件如下：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 sec，60 ℃退火、延伸34 sec，共35个循环。

1.2.3细胞培养和转染人肾近曲小管上皮细胞HK-2用含10%胎牛血清的DMEM/F12(GIBCO)培养基在37 ℃、5%CO2条件下培养。每2～3天更换培养液。待细胞生长至70%～80%融合时进行传代。取对数生长期的细胞以2×105·孔-1的密度接种于6培养孔板中，使用LipofectamineTM2000试剂将miR-155 mimics(miR-155组)、negative control(NC组)转染至HK-2，同时仅以LipofectamineTM2000试剂转染细胞者设为空白对照组(Blank组)。

1.2.4RT-PCR检测mRNA表达水平收集细胞加入RNAiso Plus (Takara)提取各组细胞总RNA。使用Nanodrop测定总RNA含量和浓度。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)将mRNA逆转录成cDNA。应用Golden Fast PCR Kit(TIANGEN)进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min。引物序列如下：β-catenin(上游5’-CTTACACCCACCATCCCACT-3’，下游5’-CCTCCACAAATTGCTGCTGT-3’)、snail(上游5’-AGGATCTCCAGGCTCGAAAG-3’，下游5’-GTAGCAGCCAGGGCCTAGAG-3’)、fibronectin(上游5’-GGACATGCATTGCCTACTCG-3’，下游5’-GAATCCTGGCATTGGTCGAC-3’)、E-cadherin(上游5’-AACAGGATGGCTGAAGGTGA-3’，下游5’-CCTTCCATGACAGACCCCTT-3’)、β-actin(上游 5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’，下游 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’)。产物经过电泳后采用凝胶分析仪扫描分析。

1.2.5Western blot检测蛋白表达水平收集细胞加入RIPA 裂解液提取各组细胞总蛋白。使用Bradford Protein Assay Kit (Beyotime)测定蛋白浓度。取50 μg总蛋白上样于SDS-PAGE凝胶中，室温下垂直电泳，0.3 A、20 V湿法电转至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭1.5 h，分别加入TBST稀释的第一抗体(兔抗人β-catenin多克隆抗体，稀释度为1∶1 000；兔抗人snail单克隆抗体，稀释度为1∶1 000；山羊抗人fibronectin多克隆抗体，稀释度为1∶500；兔抗人E-cadherin多克隆抗体，稀释度为1∶800；兔抗人β-actin多克隆抗体，稀释度为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加入HRP标记的第二抗体(稀释度1∶1 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL化学发光显影。

1.3统计学分析采用SPSS 18.0 软件包进行统计分析。数据采用均数±标准差(mean ± SD)或中位数(IQR)表示。两组间比较，若数据符合正态分布，采用t检验；若非正态分布，采用Mann-Whitney U检验。相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1研究对象的临床基线资料本研究纳入经临床和肾活检确诊为原发性IgAN患者37例(IgAN组)，因肾肿瘤行肾切除术患者16例(对照组)。两组研究对象的临床基线资料见表1。

表1　研究对象的临床基线资料

2.2miR-155表达情况及临床病理参数分析实时荧光定量PCR结果显示，miR-155在IgAN组肾活检组织中的表达水平明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)(见图1A)。对入选的37例IgAN患者临床病理参数和miR-155表达情况进行相关性分析，发现肾活检组织中miR-155表达水平与肾小球滤过率呈负相关关系(r=-0.3368,P=0.0415)，与肾小管间质纤维化程度呈正相关关系(r=0.3764,P=0.0217)(见图1B、1C)。

2.3miR-155对Wnt/β-catenin及下游基因表达的影响转染48 h、72 h后收集细胞分别提取mRNA和蛋白。RT-PCR和Western blot检测结果显示，转染miR-155 mimics上调HK-2细胞株内miR-155表达后，与阴性对照组或空白对照组相比，β-catenin表达明显增加，上皮表型标志物E-cadherin表达下降，而间质表型标志物fibronectin表达上调(P<0.05，图2、图3)。

A：肾组织中miR-155的相对表达量(**与对照组比较，P<0.01)；B：miR-155与eGFR相关性分析；C：miR-155与肾间质纤维化相关性分析。

图1miR-155在肾组织中表达及与临床病理参数相关性分析

*与对照组比较，P<0.05。

*与对照组比较，P<0.05。

3　讨　论

IgAN是当前我国终末期肾脏病最主要的病因之一, 其发病率有逐年上升的趋势。IgAN的发病机制迄今尚未完全明确，可能涉及感染、遗传、免疫和环境等多种因素。近年研究表明，肾小管间质损害尤其是肾小管间质纤维化在IgAN疾病发展过程中起着非常重要的作用。意大利学者D'Amico[4]对多项设计严谨的临床研究进行荟萃分析发现，肾小球硬化和间质纤维化是IgAN病程进展及预后不良的预测因素。而Mera等[5]的研究显示，肾小管间质损害积分对IgAN预后的预测强度高于肾小球积分。

肾小管间质纤维化是肾脏在感染、缺血、损伤以及炎症免疫反应等多种因素刺激下，固有细胞和间质受损，炎症介质、细胞因子释放，导致肾小管上皮-间充质细胞转化、肌成纤维细胞异常增殖和细胞外基质过度积聚，最终造成肾脏固有结构破坏、间质硬化。肾小管间质纤维化的形成和发展是一个动态的病理过程，涉及多种细胞因子和信号通路的异常表达调控，如TGF-β1、IGF及JAK/STAT通路、PI3K通路、Wnt/β-catenin通路等[6]。其中以Wnt/β-catenin信号通路的研究较为深入。利用单侧输尿管结扎(UUO)肾间质纤维化的动物模型，研究人员证实了Wnt、β-catenin及其下游靶基因MMP-7、FN等在慢性肾损伤过程中被诱导表达[7-9]；而采用ICG-001特异性阻断Wnt/β-catenin/CBP信号通路可有效抑制鼠肾脏纤维化的进展[10]。我们既往的研究亦发现，β-catenin在伴有肾小管间质病变的IgAN 患者肾脏活检组织中表达水平高于不伴肾小管间质病变的IgAN患者，提示Wnt/β-catenin通路在IgAN疾病进展过程中被激活，参与IgAN肾小管间质纤维化的形成[11]。

随着研究的深入，miRNA在肾小管间质纤维化中的作用受到越来越多的关注，成为目前研究的热点之一。2007年Kato等[12]率先报道了miRNA-192可以通过靶向抑制SIP1表达，在调控TGF-β1诱导糖尿病肾病肾组织内胶原的生成中发挥重要的作用。Oba S等[13]采用UUO肾间质纤维化小鼠模型研究发现，miR-200的表达呈时间依赖性上调；静脉注射miR-200b前体可抑制Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和纤维连接蛋白的生成，减轻肾间质纤维化程度。此外，Wang等[14]检测发现IgAN患者尿液中miR-93表达水平高于健康对照组，且与SMAD3表达及肾小球硬化显著相关，提示miR-93可能通过TGF-β1/SMAD3信号通路调控，参与IgAN肾脏纤维化进程。在本研究中，我们通过荧光定量PCR技术检测发现，IgAN患者肾活检组织中miR-155表达水平显著高于对照组(P<0.01)，而且miR-155表达量与肾小管间质纤维化呈正相关关系(r=0.3764,P=0.0217)，这与Wang等[15]的研究结果相一致。我们利用脂质体介导miR-155模拟物瞬时转染进行体外细胞实验证实，上调miR-155表达可激活Wnt/β-catenin信号通路，增强间质表型标志物fibronectin表达，促进上皮间质转化。上述研究结果提示，miR-155的表达上调与IgAN肾小管间质纤维化密切相关，其可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路参与IgAN的进展。miR-155具体的作用靶点及其调控机制还有待进一步深入研究。

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The Association of Wnt/β-catenin Signaling Pathway Regulated by miR-155 with Renal Interstitial Fibrosis in IgA Nephropathy

YEWei-biao1,LIYi1,LIUTao2,WANGZhen1,LIZhong-jun1,HUANGSu-ran1

(1.DongguanHospitalofSouthernMedicalUniversity,DongguanGuandong523059;2.GuangdongGeneralHospital,GuangzhouGuandong510080)

Objective: To investigate the expression of miR-155 in patients with immunoglobulin A nephropathy (IgAN), and to analyze its role in renal interstitial fibrosis. Methods: The expression levels of miR-155 within kidney biopsies were assessed by real-time quantitative RT-PCR. miR-155 mimics were transiently transfected into human proximal tubule epithelial cells (HK-2). The expression of epithelial and mesenchymal markers as well as transcriptional regulators in Wnt/β-catenin signaling pathway were detected by RT-PCR and Western blotting. Results: Higher miR-155 expression was found in renal biopsy tissues from IgAN patients compared to controls (P<0.01). The expression levels of miR-155 were positively correlated with renal interstitial fibrosis, but were inversely correlated with estimated glomerular filtration rate. Up-regulation of miR-155 induced the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway, which in turn increased fibronectin and reduced E-cadherin expression. Conclusion: miR-155 was elevated in IgAN patients, and the increased levels were correlated with the severity of renal interstitial fibrosis. This indicates that miR-155 may play a critical role in the pathogenesis of IgAN.

miR-155; Wnt/β-catenin; Immunoglobulin A nephropathy (IgAN); Renal interstitial fibrosis

广东省教育厅临床教学基地教学改革研究项目(2014JDB067)；东莞市科技计划医疗卫生类科研一般项目(No.2015105101192、No.2014105101200)

R692.3

A

1001-5779(2016)03-0358-05

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.007

2016-02-17)(责任编辑：敖慧斌)