非小细胞肺癌组织中膜联蛋白A2表达及其临床意义*

杜志明，曾　娟，余俊键，章祖雄，谢春发，唐志贤

(赣南医学院第一附属医院心胸外科，江西　赣州　341000)



非小细胞肺癌组织中膜联蛋白A2表达及其临床意义*

杜志明，曾娟，余俊键，章祖雄，谢春发，唐志贤

(赣南医学院第一附属医院心胸外科，江西赣州341000)

目的：探讨膜联蛋白A2在非小细胞肺癌临床诊断、治疗和预后中的价值。方法：回顾分析在我院于2009年6月～2010年6月就诊128例患者标本，其中正常肺组织组30例，非小细胞肺癌组98例。采用RT-PCR和免疫组化分别检测两组标本中膜联蛋白A2基因水平及蛋白水平的表达，并结合肺癌患者随访数据运用Kaplan-Meier方法进行生存期分析。结果：膜联蛋白A2在肺癌组织中呈高表达，并且分化程度越差、淋巴结转移率越高及临床分期越差ANXA2的表达越高(P<0.05)。生存分析提示ANXA2的阳性组的生存期较ANXA2阴性组的低(P<0.001)。结论：膜联蛋白A2在非小细胞肺癌中的高表达与肿瘤的侵袭和转移相关，能辅助判断患者预后；并可能成为非小细胞肺癌中一个新的治疗靶点。

膜联蛋白A2；非小细胞肺癌；RT-PCR；免疫组化

肺癌目前是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，总体的治疗效果和预后都不理想，其五年的生存率只有15%[1]，其发病率与死亡率已跃居我国首位。膜联蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)是一种广泛存在真核生物中钙离子依赖性家族成员，并广泛参与依赖于钙调蛋白的活动，包括钙离子通道的形成、调控炎症反应、DNA修复合成、细胞分化与凋亡、细胞增殖、细胞骨架活动、成信号转导等[2]。近来多项研究表明，ANXA2在多种肿瘤中表达失调，且其表达水平和肿瘤的发生、浸润、转移、病理阶段密切相关[3]。目前国内研究ANXA2在肺癌患者表达与生存期关系较少。本研究通过PT-PCR及免疫组化法联合检测ANXA2在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)与正常组织中的表达情况，分析其与肿瘤恶性程度、侵袭转移能力等临床病理因素间的关系，探讨ANXA2在与NSCLC组织中的表达及其与NSCLC发生、发展及患者生存期的关系。

1　资料与方法

1.1标本及病理资料肺癌石蜡标本98例，男性58例 ,女性40例，年龄25～76岁。非肿瘤肺组织标本(慢性肺炎或肺部外伤)30例，男性12例，女性6例，年龄2l～70岁。所有标本来自赣南医学院第一医院2O09年6月～2010年6月门诊和住院患者，所取组织分为两部分，一部分用于PCR检测标本均为液氮速冻，并在-80 ℃冰箱保存；另一部分用10%福尔马林固定，石蜡包埋，作5 m连续切片。所有石蜡标本均经2位病理医师确诊。在非小细胞肺癌中高分化32例，中分化23例，低分化43例。随访至2015年6月，共随访98例，另外失访7例按截尾值处理。其中Ⅰ～Ⅱ期肿瘤患者占36.73%(36/98)；Ⅲ～Ⅳ期患者占63.27%(62/98)。

1.2半定量RT-PCR使用RT-PCR方法来检测30例肺癌组织和30例正常肺组织中ANXA2的表达水平。用GAPDH作为内参照，采用Trizol法(北京TIANGEN生物技术公司)来提取组织中的ANXA2，PCR引物序列及扩展产物如下：ANXA2(213碱基对)的引物是5′-GATGTGAAACACTTTGCTCCT-3′(正义链)和5′-ATAGCGACACTTGGATAGGGG-3′(反义链)。GAPDH(224碱基对)的引物5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′(正义链)和5′-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′(反义链)。循环条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 45 s，扩增72 ℃ 60 s，循环35次；延伸72 ℃ 7 min。电泳鉴定并用凝胶成像系统(GelDot-It 300)照像，并用图像分析软件分析光密度值，计算相对系数。相对系数=细胞因子表达强度/GAPDH表达强度。

1.3免疫组化

1.3.1免疫组化方法采用免疫组织化学染色方法检测98例肺癌组织中ANXA2的表达。免疫组化采用S-P法，按照试剂的说明书进行。主要步骤如下：①切片常规脱蜡至水化，PBS冲洗3次，约3 min·次-1；②抗原高温修复；③加试剂A(过氧化物酶阻断剂)，37 ℃，10 min；④PBS冲洗3次，每次3 min·次-1，加试剂B(非免疫动物血清)，37 ℃，10 min；⑤甩掉血清，加入50 μL的膜联蛋白A2 一抗(浓度1∶200)，4 ℃冰箱中过夜；⑥PBS冲洗3次，3 min·次-1， 然后加试剂C(生物素标记的二抗)，37 ℃，10 min；⑦PBS冲洗3次，3 min·次-1，加试剂D(链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液)，37 ℃，10 min；⑧PBS冲洗3次，每次3 min，加新鲜配制的DAB显色剂，显色3～5 min；⑨自来水冲洗，苏木素复染；⑩乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3.2结果判断ANXA2免疫组化反应的阳性物质主要定位于胞浆和胞膜，表达为棕黄色颗粒。结果判定：用双盲法在每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个瘤细胞，组织切片示胞质或胞膜染为淡黄色或棕黄色为阳性细胞标志。根据肿瘤细胞的染色程度及染色细胞百分率分析评分,着色强度分为：无色(-)为0分、浅黄色(+)为1分、黄色及更深颜色(++)为2分。着色细胞占计数细胞百分率：=50%为0分、51%～75%为1分、>75%为2分。两项得分相乘结果=2分为阳性病例。

1.4统计学处理实验结果应用SPSS 14.0统计软件包，组间比较行χ2检验及t检验。根据随访结果行Kaplan-Meier生存分析。P<0.05认为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1ANXA2在肺癌组织与正常组织中表达情况30例肺癌组织与正常组织通过半定量RT-PCR测定ANXA2表达相对值，肺癌组织中表达相对值为：1.37±0.40，正常组织中表达相对值为：0.48±0.36。肺癌组织中ANXA2表达高于正常组织，两者差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1　ANXA2 mRNA在肺癌组织与正常肺组织中表达相对值

2.2ANXA2在肺癌组织中表达与临床指标的关系98例非小细胞肺癌组织行免疫组化检测并结合临床指标进行χ2检验。ANXA2在NSCLC中表达与年龄、性别、组织学类型及肿瘤大小无关，差异无统计学意义(P>0.05)，而与分化程度、淋巴结转移、临床分期有关，差异有统计学意义(P<0.05)。分化程度越低、淋巴结有转移及临床分期越差ANXA2表达的阳性率就越高。见表2。

表2　ANXA2在肺癌组织中表达与临床指标的关系

2.3ANXA2阴性及阳性患者的生存曲线在对98例ANXA2表达阳性及阴性的患者进行随访，并进行Kaplan-Meier生存分析，提示ANXA2阳性患者的生存期低于阴性患者，两者差异有统计学意义(P<0.001)。见图1。

图1　ANXA2阴性及阳性患者的生存曲线

3　讨　论

肺癌的发病率及死亡率已经跃居所有肿瘤之首，并且发病率有逐年增高趋势。ANXA2作为在影响分子和细胞进程的多效蛋白，已经有大量的证据显示它的异常表达，对肿瘤细胞的粘附、增殖、凋亡、侵袭和转移以及肿瘤新血管形成造成深远的影响[4]。肿瘤的生长过程中是肿瘤新生血管较肿瘤组织更先生长。定位于肿瘤细胞表面的ANXA2作为多种蛋白酶及细胞基质的结合位点，促进细胞外基质成分降解及肿瘤新生血管形成。本研究通过RT-PCR分析提示，在肺癌组织中ANXA2的表达水平高于正常组织(P<0.001)，这与Ohno Y[5]的研究相一致。在NSCLC免疫组化中我们发现，ANXA2的表达与年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小均无关(P>0.05),而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移情况及临床分期有关，并且分化程度越差、淋巴结转移率越高及临床分期越差ANXA2的表达越高(P<0.05)。以上结果说明ANXA2具有促肺癌细胞增殖和侵袭的作用[6]，可能是通过ANXA2调节MMP-2和组织蛋白酶B表达起作用[7-8]。而通过静默ANXA2的表达可以降低肿瘤的侵袭力和转移力[9]。

在Kaplan-Meier生存分析中，ANXA2的阳性组的生存期较ANXA2阴性组的低(P<0.001)。单因素分析显示，ANXA2的阳性与总体的生存率有关。多因素分析显示ANXA2的表达与一些传统的因素(肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及临床分期)密切相关。这些结果都表明，ANXA2在非小细胞肺癌患者中的高表达提示该患者预后差[10]。

综上所述，本研究结果提示ANXA2在非小细胞肺癌中的高表达与肿瘤的侵袭和转移相关，但其在肿瘤中的发展进程中的机制尚待我们进一步去探索。相信随着ANXA2与恶性肿瘤发展关系的深入研究，它有望被开发为用于非小细胞肺癌及其转移的早期检测、辅助诊断及治疗的靶分子。

[1]Christofori G.New signals from the invasive front[J].Nature,2006,441(7092):444-450.

[2]Chasserot-Golaz S,Vitale N,Umbrecht-Jenck E,et al.Annexin 2 promotes the formation of lipid microdomains required for calcium-regulated exocytosis of dense-core vesicles[J].Mol Biol Cell,2005,16(3):1108-1119.[3]Pasini A,Paganelli G,Tesei A,et al.Specific Biomarkers Are Associated with Docetaxeland Gemcitabine-Resistant NSCLC Cell Lines[J].Transl Oncol,2012,5(6):461-468.

[4]Xu XH,Pan W,Kang LH,et al.Association of annexin A2 with cancer development (Review)[J].Oncol Rep,2015,33(5):2121-2128.

[5]Ohno Y,Izumi M,Kawamura T,et al.Annexin II represents metastatic potential in clear-cell renal cell carcinoma[J].Br J Cancer,2009,101(2):287-294.

[6]高昕,王述民,曲家骐,等.Annexin A2基因沉默对肺癌细胞转移能力的影响[J].中国免疫学杂志,2012,(12):1082-1086.

[7]Wang YX,Lv H,Li ZX,et al.Effect of shRNA mediated down-regulation of Annexin A2 on biological behavior of human lung adencarcinoma cells A549[J].Pathol Oncol Res,2012,18(2):183-190.

[8]Jia JW,Li KL,Wu JX,et al.Clinical significance of annexin II expression in human non-small cell lung cancer[J].Tumour Biol,2013,34(3):1767-1771.

[9]Zhang HJ,Yao DF,Yao M,et al.Annexin A2 silencing inhibits invasion, migration,and tumorigenic potential of hepatoma cells[J].World J Gastroenterol,2013,19(24):3792-3801.

[10]Wang CY,Chen CL,Tseng YL,et al.Annexin A2 silencing induces G2 arrest of non-small cell lung cancer cells through p53-dependent and independent mechanisms[J].J Biol Chem,2012,287(39):32512-32524.

The Expression of Annexin A2 in the Tissues of Non-small-cell Lung Cancer and its Clinical Significance

DUZhi-ming,ZENGJuan,YUJun-jian,ZHANGZu-xiong,XIEChun-fa,TANGZhi-xian

(Dept.ofCardiothoracicSurgery,theFirst-affiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,GanzhouJiangxi341000)

Objective: To study the significance of Annexin A2 in the diagnosis, treatment, and prognosis of non-small cell lung cancer. Methods: One-hundred and twenty-eight clinical cases from our hospital were analyzed retrospectively from June 2009 to June 2010. They were divided into 2 groups, normal group (n=30) and non-small cell lung cancer (n=98). The gene expression and protein levels of Annexin A2 in two group specimens were measured by RT-PCR and immunohistochemistry, respectively. In addition, survival analysis was performed through Kaplan-Meier methods based on follow-up data of patients. Results: In comparison with normal group, the expression levels of Annexin A2 was significantly higher in lung cancer group; High Annexin A2 expression was positively correlated with the less degree of differentiation, higher rate of lymph node metastasis, and worse clinical stages (P<0.05). Survival analysis showed that the patients' survival time of ANXA2 positive group was significantly shorter than those of ANXA2 negative group (P<0.001). Conclusion: Annexin A2 may play an important role in the process of invasion and metastasis, and can predict the prognosis in non-small cell lung cancer, thus becoming a novel therapeutic target.

Annexin A2；Non-small-cell lung cancer；RT-PCR；Immunohistochemistry

2013年江西省赣州市指导性科技计划项目

唐志贤，男，博士，副主任医师，从事心胸外科专业。E-mail：tzhixian@126.com

R734.2

A

1001-5779(2016)03-0377-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.013

2016-02-25)(责任编辑：敖慧斌)