与Aβ42结合的噬菌体展示多肽的淘选△

张　燃

（宁夏职业技术学院银川750021）

与Aβ42结合的噬菌体展示多肽的淘选△

张燃

（宁夏职业技术学院银川750021）

阿兹海默症（Alzheimer’s disease,AD），即老年痴呆，是一种十分常见的神经系统退行性疾病，β-淀粉样蛋白（Aβ）在细胞外异常聚集、沉积是其致病机制之一。目的：筛选与Aβ42集合的噬菌体多肽。方法：本实验以Aβ42寡聚体为靶蛋白，对随机环形噬菌体七肽库进行筛选，对于筛选的结果用酶联免疫吸附试验进行验证。结果：得到200株噬菌体克隆，全部为阳性并且部分与Aβ42的结合力极强。结论：通过对随机环形噬菌体七肽库筛选可得到与靶蛋白（Aβ42）结合的噬菌体阳性克隆，理论上这些阳性噬菌体所展示的多肽可以作为配体与Aβ42（受体）结合，而这种结合则有可能影响Aβ42寡聚体的聚集和沉淀，从而为阿兹海默症的治疗提供某些支持。

阿兹海默症 β-淀粉样蛋白 生物淘选

阿兹海默症（Alzheimer’s disease,AD），即老年痴呆，是一种十分常见的神经系统退行性疾病[1]。AD主要有三大病理特征[2，3]，分别为老年斑（Senile plaque，SP），神经元纤维缠结（Neurofibrillary tangles，NFT）以及由退行性突触病变和神经元死亡造成的广泛性脑萎缩。其中老年斑主要分布于大脑皮质和基底神经节等处，其斑块主要是由β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）在细胞外异常聚集、沉积而形成的。目前，AD的病因和致病机制仍然没有被完全阐明，主要有Aβ学说、TAU蛋白异常磷酸化学说、神经凋亡学说等，其中Aβ学说逐渐占据主流地位。

1　材料

1.1环形七肽库及所用菌株：Ph.D.-C7CTM环肽库购自New England Biolabs、大肠杆菌ER2738。

1.2主要试剂及仪器

1.2.1主要试剂及培养基：噬菌体表面衣壳蛋白Ⅲ展示随机环形七肽库（Ph.D.-C7C Phage Peptide Library）试剂盒、异丙基-β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-8000、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopy，X-gal）、六氟异丙醇（HFIP）、二甲基亚砜（DMSO）、十二烷基磺酸钠（SDS）、Tween-20、蛋白胨、酵母粉、聚苯乙烯小皿、酶联免疫吸附板、牛血清白蛋白（BSA）、TMB显色底物。

1.2.2主要仪器：①KQ3200B型超声波清洗器；②Infinite F200型酶标仪；③数显电热培养箱；④磁力搅拌器；⑤超净工作台；⑥ZS-3板式酶标仪；⑦电子天平；⑧pH计；⑨全自动灭菌锅；⑩水平摇床；輥輯訛冷冻离心机。

2　实验方法

2.1蛋白处理：Aβ42：用20mMpH 7.2的PBS溶至25μM，孵育得到寡聚体。

2.2噬菌体随机七肽库与结合Aβ寡聚体多肽的生物淘选

2.2.1分别将1.5mL，5％的BSA溶剂加至聚苯乙烯小皿A、B中，4℃包被过夜，备用。

2.2.2按以上方法制备Aβ42寡聚体，分别取已制备好的Aβ4240μg稀释于1.5mLTBS中，分别加至聚乙烯平皿C、D中，4℃包被2h，分别加入1.5mL，5％的BSA，37℃封闭2h，备用。

2.2.3弃掉聚苯乙烯皿A中的包被液后，将平板倒置于干净的纸巾上用力拍甩，以去除残余溶液。取1.5mLEP管，将10μL环形七肽库（噬菌体个数为2×1011个病毒子），稀释于1.1mL TBS中，均匀铺开至平皿A中，室温温和摇动1h，将A皿中的液体移至B皿中，继续室温温和摇动1h。弃掉聚苯乙烯皿C中的蛋白溶液，将B皿中的液体移至C皿中，室温温和摇动2h，t弃去D皿中的蛋白液体，将C皿中的液体移至D皿中，室温温和摇动2h。

2.2.4弃掉D皿中未结合的噬菌体，再用TBST（TBS+0.1％ Tween-20）缓冲液快速洗板10次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘都被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液。

2.2.5用1mL 0.2M Glycine-HCl（pH2.2），洗脱已结合的分子，温和振动20min。

2.2.6洗脱液吸入另一干净EP管，迅速用150μL 1M Tris-HCl（pH9.1）中和。洗脱物4℃贮存过夜。挑取ER2738单克隆（噬菌体滴度测定时铺的板）于5mL LB液体培养基中，加5μL四环素，37℃10000rpm震荡培养过夜。

2.2.7将过夜菌加入5mLLB液体培养基中，加5μL四环素，37℃10000rpm震荡培养2.5h至细菌对数期。将洗脱物，20μL四环素和200μL的对数期菌加入20mL LB培养基中。37℃摇动培养4.5h。

2.2.8将培养得到的产物转到一离心管中，4℃10000rpm，离心15min。将离心得到的上清转移到另一离心管中，同样条件，离心5min。

2.2.9取80％的上清转移至一新的离心管中，加入1/6～1/4体积的PEG/NaCl。4℃冰浴8h。

2.2.10冰浴后，继续4℃，10000rpm，离心15min。将上清液小心倒去，再相同条件下离心5min，弃去残留上清。

2.2.11将下部沉淀重悬于1mLTBS中，4℃离心5min，沉淀细胞残片。

2.2.12沉淀物重悬于200μL TBS,0.02％NaN3中。此即为扩增后的洗脱物，4℃贮存。

2.2.13用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。从LB-Tet平板上挑ER2738单菌落于5mL LB培养基中，另加5μL四环素，37℃振荡培养过夜，1∶100转接至5mL LB培养基中，另加5μL四环，37℃振荡培养2h至对数中期（OD600值约0.5）。同时，用电磁炉融化顶层琼脂，按照3mL每等分分装与多个灭菌试管中，保存于55℃备用。提前37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每一个噬菌体滴度准备两个平板。在LB培养基中稀释噬菌体达所测的滴度。扩增后的噬菌体培养物：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。

对数菌摇好后，每等分200μL分与1.5mLEP管中，每个噬菌体稀释滴度一管。每管分别加入10μL不同滴度的稀释好的噬菌体，吹吸混匀，室温孵育5min。将侵染好噬菌体的菌液快速加入到预温的3mL顶层琼脂中，快速混匀，立刻将其平铺于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。待平板冷却5min后，用封口膜包好，37℃，倒置培养过夜。10h后，观察平板，选择有约102个噬菌斑的平板计数并算得噬菌体滴度。

2.2.14如果滴度合适，再次制备Aβ42寡聚体，取30μg稀释于1.5mLTBS中，4℃包被2h于另一小皿中，之后加入1.5mL，5％的BSA，37℃封闭2h，为第二轮筛选备用。在进行第二轮淘选时，加入2×1011pfu的噬菌体，将Tween的浓度增至0.3％（v/v）。在LB/ IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。再以同样的方法，用15μg Aβ42寡聚体包被一个皿准备第三轮淘选时用。

2.2.15第三轮淘选：按照其第二轮扩增后的噬菌体滴度，加入2×1011pfu的噬菌体，使用0.7％（v/v）的Tween20进行清洗。同样方法测得第三轮扩增后的噬菌体滴度。如果滴度合适，再包被一个小皿为第四轮淘选备用。

2.2.16第四轮淘选：同样方法淘选并测定第四轮洗脱后的滴度。滴度合适，便不必再扩增，滴度测定时得到的噬菌斑可做DNA测序用，其余洗脱物4℃贮存。

2.3噬菌体单克隆的挑取及扩增：①准备ER2738过夜菌，然后利用过夜菌制备对数菌。②根据第四轮洗脱后所测定的噬菌体滴度，选取适当的比例（102pfu/10μL）进行涂板，同时涂3-4个平板，37℃温箱培养12h。准备LB培养基，按100∶1加入对数菌，1000∶1加入TET，摇匀后，分别加入到灭菌试管中，每个试管1mL。③待噬菌斑长出后，开始挑取单个的噬菌斑于各个试管中，37℃摇床上培养4.5h。④分别将扩增好的噬菌体转移至1.5mL的EP管中，做好编号，4℃，13000rpm离心15min,弃沉淀。⑤将上清转移至新EP管中，加入总体积1/5的PEG/NaCL, 4℃静置2h，4℃，13000rpm离心15min，噬菌体便沉淀于管底。⑥小心抽去上清液体，将沉淀得到的噬菌体重悬于120μL的TBS中，以备后续实验。

2.4ELISA鉴定噬菌体阳性克隆：按前面所讲的方法制备Aβ42寡聚体，以1μg/孔的浓度包被ELISA板同时以50μL的PBS设置对照孔，置4℃过夜。弃去孔中的溶液，每孔加入3％的BSA 280μL，置37℃温箱中2个小时。弃去孔中的溶液，用20mM的PBS缓冲液轻轻涮一下，将之前制备好的单克隆噬菌体进行编号，各取10μL稀释于50μLTBS中，加于每孔，置37℃温箱中2个小时。弃去孔中的溶液，用0.3％的洗涤缓冲液PBST洗6遍，每次1分钟，轻拍。加入用3％的BSA稀释的HRP-抗M13噬菌体抗体（1∶5000），每孔各加入50μL，置37℃温箱中2个小时。弃去孔中的溶液，用0.1％的洗涤缓冲液PBST洗6遍，轻拍。加入TMB避光显色10分钟后观察。于各反应孔中加入2M硫酸50μL。在酶标仪上以450nm测各孔OD值。实验重复3次。

3　实验结果

淘选一共进行了四轮，四轮淘选的结果分别为：第一轮：未扩增的淘选洗脱物：102，扩增后的噬菌体培养物：108；第二轮：未扩增的淘选洗脱物：102，扩增后的噬菌体培养物：108；第三轮：未扩增的淘选洗脱物：103，扩增后的噬菌体培养物：109；第四轮：未扩增的淘选洗脱物：103，扩增后的噬菌体培养物：1010，符合此淘选试验的试验指导：未扩增的淘选洗脱物：101-104；扩增后的噬菌体培养物滴度应在：108-1011。接下来通过稀释涂布平板的方法挑取了200株噬菌体单克隆并扩增，之后用Aβ42寡聚体通过ELISA对这200株噬菌体单克隆进行阳性验证试验，从结果可看出：筛选出来的200株噬菌体单克隆，均为阳性克隆，部分结果如下图所示：

其中编号为3、7、12、19、32、33、49、54、59、62、76、79、94、103、121、150、163、185、192、197的噬菌体阳性克隆与Aβ42寡聚体蛋白结合的能力极强。至此与Aβ42寡聚体结合的噬菌体展示多肽被成功淘选出来。

4　讨论

噬菌体环形肽库筛选是基于噬菌体展示的一项筛选技术，它利用噬菌体的衣壳蛋白可以很好的表达外源蛋白这一原理，将大量的外源的蛋白融合表达于噬菌体表面，通过生物淘选获得与目标靶蛋白结合的配体。

Aβ为β淀粉样蛋白前体蛋白（β-APP）的异常水解产物，它含有40-42个氨基酸，即Aβ40或Aβ42[4]，分子量约为4kD。Aβ可溶性的单体及不溶性的大纤维被认为毒性较弱，可溶性寡聚体（为2-20个左右单体构成的寡聚体）是最主要的毒性形式[5]。而由Aβ特异性聚集、沉淀引起的主要毒性机制则包括了：氧化应激、线粒体损伤、钙离子稳态失衡、炎症反应、Tau蛋白的异常磷酸化和NFT的形成等。

本实验以Aβ42寡聚体为把蛋白，通过对Ph.D.-C7C噬菌体库的淘选，我们成功得到了200株噬菌体阳性克隆。其中部分阳性克隆与Aβ42寡聚体结合力极强，理论上这部分噬菌体阳性克隆所展示的外壳蛋白多肽应该是可以与Aβ42寡聚体结合的。

后续仍有很多验证工作要做，首先是对于这20株噬菌体阳性克隆提取DNA，进行测序并且对测序结果进行同源性比对。其次挑选出同源性较高的氨基酸序列，按照其组成来体外合成蛋白多肽。最后需要验证这些蛋白多肽是否与Aβ42寡聚体结合以及其结合力的高低结。这些蛋白多肽一旦与Aβ42寡聚体结合就很有可能影响淀粉样蛋白的异常聚集、沉淀、细胞毒性等生物学特性，这样便给利用多肽制剂或药物治疗AD提供一些理论上的支持。

[1]Cummings JL（2004）Alzheimer's disease.N Engl J Med 351: 56-67.

[2]Frackowiak J,Mazur-Kolecka B,Kaczmarski W,Dickson D（2001）Deposition of Alzheimer's vascular amyloid-beta is associated with decreased expression of brain L-3-hydroxyacylcoenzyme A dehydrogenase（ERAB）.Brain Res 907：44-53.

[3]Selkoe DJ（2003）Folding proteins in fatal ways.Nature 426: 00-904.

[4]盛树立.老年性痴呆及相关疾病[M].科学技术文献出版社，2003：3-10.

[5]Parihar MS,Hemnani T（2004）Alzheimer's disease pathogenesis and therapeutic interventions.J Clin Neurosci 11:456-467.

△宁夏职业技术学院（或宁夏广播电视大学）科研发展基金资助

R749.1+6

B

1672-8351（2016）10-0126-02