重组腺相关病毒基因药物三种滴度的比较与分析

2021-07-30 02:18王晓黄晓平黎玲刁勇
关键词:滴度质粒基因组

王晓, 黄晓平, 黎玲, 刁勇

(1. 华侨大学 医学院, 福建 泉州 362021;2. 泉州师范学院 化工与材料学院, 福建 泉州 362000)

重组腺相关病毒(rAAV)是一种无包膜的单链DNA病毒,因自身复制缺陷、基因组结构简单、免疫原性小等优点,被认为是目前最安全的基因治疗载体之一[1-2].近年来,rAAV载体作为基因治疗载体已在遗传性疾病、癌症、干细胞和神经退行性疾病等研究中取得了显著的治疗效果[3-6].目前,世界范围内有100余项以rAAV为载体的基因药物已完成或正在进行临床研究[7].2017年12月,治疗遗传性视网膜病变的基因药物Luxturna上市[8],这给基因治疗带来了美好前景.然而,规模化制备和质量控制等因素制约了rAAV在临床上的应用,尤其是缺少准确、可靠的rAAV滴度定量标准方法,这使不同实验室的rAAV剂量由于缺少参比标准而无法进行归一化处理.

rAAV滴度分为衣壳滴度、基因组滴度、转导滴度和感染滴度等.目前,临床剂量通常基于rAAV 载体的基因组滴度,准确地定量载体是药物获得最大疗效和最小毒性的前提条件[9],也是不同工艺和不同厂家产品横向比较的依据[10-11].实时荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR)是常用的rAAV基因组滴度测定法,但传统的Q-PCR具有适用范围窄、易产生系统性误差和易受杂质干扰等缺点[11-12];采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定衣壳滴度的价格昂贵,且无法区分空心病毒;转导滴度受转基因和细胞的限制,不具有普适性;感染滴度测定需要腺病毒辅助,再提取细胞DNA,通过Q-PCR测定病毒基因组拷贝数,测定过程繁琐,尚未广泛得到应用.腺相关病毒参比标准事务委员会推荐ELISA,Q-PCR,半数组织培养感染剂量(TCID50)等方法一起使用,作为rAAV 检定的测量方法[13].由于TCID50的测量过程繁琐、费时费力,故采用转导方法代替TCID50.基于此,本文采用ELISA,Q-PCR和转导方法对实验室制备的rAAV进行定量.

1 材料与方法

1.1 质粒与细胞株

质粒pCMV-ITR-GFP,pH22,pdf6为实验室保存;细胞株293T购自美国模式菌种收藏中心(ATCC).

1.2 主要试剂

Real-time PCR试剂盒(美国Thermo Fisher公司);AAV2 Titration ELISA试剂盒(德国PROGEN Biotechnik公司);RNase(北京市庄盟生物科技公司);氯化铯(德国Sigma公司);Benzonase(德国Merk公司);聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI,美国Polysciences公司);DMEM,1640培养基和胎牛血清(美国Gibco公司).

1.3 rAAV的制备

参照实验室建立的制备rAAV方法,当293T细胞密度为85%时,进行三质粒共转染,质粒与PEI按照质量比为1∶3进行混合,静置后加入293T细胞中;72 h后收获病毒,进行氯化铯梯度离心分离、透析和浓缩,制备rAAV,共制备3批rAAV,后续实验每批重复3次.

1.4 ELISA测定rAAV衣壳滴度

采用AAV2 Titration ELISA试剂盒对rAAV进行定量.首先,将试剂盒中的标准品稀释至107~109P·mL-1范围内,以标准样品浓度的对数值(lgCs)为横坐标,以其光密度的对数值(lgD)为纵坐标,绘制rAAV标准曲线(图1).然后,将rAAV2原液进行稀释,按照说明书进行操作,酶标仪读取光密度D450,通过标准曲线计算rAAV2衣壳滴度.

图1 rAAV标准曲线

1.5 Q-PCR测定rAAV基因组滴度

以GFPF5′-GAGCGCACCATCTTCTTCAA-3′;GFPR5′-TCCTTGAAGTCGATGCCCTT-3′为引物,以SYB-R Green为染料,反应体系为25 μL,反应条件为94 ℃变性20 s,60 ℃退火延伸40 s,40个反应循环.

1.6 转导滴度的测定

制备293T细胞悬液密度为1×105个·mL-1,按照100 μL·孔-1接种至96孔板,待细胞贴壁后加入rAAV;取10 μL病毒原液,按10倍进行梯度稀释,取10 μL稀释后的rAAV加入96孔板中;4 h后,更换为新鲜培养液并添加丁酸钠;24 h后,观察荧光表达情况,在最高稀释梯度的孔中计算绿色荧光细胞数目,可得rAAV的转导滴度.

2 结果与分析

2.1 rAAV衣壳滴度

rAAV标准曲线的回归方程为y=0.915x-8.032,相关系数R2=0.998,根据标准曲线计算3批包装、纯化的rAAV的衣壳滴度,结果如表1所示.表1中:SD为标准差.由表1计算可知:3批rAAV平均衣壳滴度为3.65×1013P·mL-1;不同批次制备得到的rAAV产量相差2倍左右,这是因为rAAV在制备过程中受到细胞状态、数目、转染条件和纯化工艺等的影响.

表1 不同批次的rAAV衣壳滴度

2.2 rAAV基因组滴度

以质粒pAMG-EGFP为标准品,绘制Q-PCR扩增曲线和标准曲线,如图2所示.图2中:ΔRn为产物的荧光值;C为循环次数;Ct为扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时,荧光值对应的PCR循环次数;R2=0.998.依据标准曲线计算3批rAAV基因组滴度,结果如表2所示.由表2计算可知:3批rAAV平均基因组滴度为8.67×1011GC·mL-1.ELISA方法测得的rAAV不仅包括实心病毒、空心病毒,还包括不完整病毒.因此,ELISA测定的衣壳滴度一般比基因组滴度大,衣壳滴度与基因组的比值P/GC能体现rAAV在包装和纯化过程中的工艺优劣.腺相关病毒参比标准事务委员会推出AAV2标准品的P/GC为28,而实验室制备的3批rAAV的P/GC分别为42.16,40.33,42.61(平均值为41.70),与AAV2标准品的P/GC较为接近.

(a) Q-PCR扩增曲线 (b) Q-PCR标准曲线

表2 不同批次的rAAV基因组滴度

2.3 rAAV转导滴度

以感染复数(MOI)为250∶1,500∶1,1 000∶1分别转导Hela细胞,其荧光表达情况,如图3所示.由图3可知:随着MOI增大,表达绿色荧光的细胞数目增多.rAAV经过稀释后转导293T细胞,观察表达GFP细胞数目,统计分析得到rAAV转导滴度,如表3所示.由表3计算可知:3批rAAV平均转导滴度为9.85×109TU·mL-1.基因组滴度与转导滴度的比值GC/TU可反映rAAV的转染、亲嗜和表达能力的优劣,GC/TU越小,则能力越强.腺相关病毒参比标准事务委员会推出AAV2标准品的GC/TU为64.4,实验室制备的3批rAAV的GC/TU分别为88.45,88.58,87.58(平均值为88.20),与AAV2标准品的GC/TU较为接近.

(a) MOI=250∶1 (b) MOI=500∶1 (c) MOI=1 000∶1

表3 不同批次的rAAV转导滴度

3 讨论

目前,多数实验室对rAAV滴度定量采用Q-PCR方法,但Q-PCR只能测定rAAV包裹的基因组,无法测定空壳rAAV,而空壳rAAV不仅不会表达转基因,反而会引起免疫反应[14-20].文中利用ELISA,Q-PCR和转导方法,分别测定rAAV的衣壳滴度、基因组滴度和转导滴度,并计算其P/GC平均值为41.70,GC/TU平均值为88.20,这与AAV2标准品的P/GC,GC/TU较为接近[21],表明制备的rAAV质量与标准品相当.

rAAV基因药物的临床研究已充分证实其具有有效性和安全性,但临床试验仍发现rAAV衣壳蛋白会引起严重的细胞免疫毒性.建立完整的rAAV基因药物的质量控制体系,降低免疫反应,需要保证rAAV转基因药效的同时尽量减少剂量[16],这要求rAAV的纯度高、空壳少、亲嗜性高.单一的基因组滴度或转导滴度无法反映rAAV的质量标准,因此,在rAAV质量标准建立时,需要测定rAAV的衣壳滴度、基因组滴度和转导滴度,文中研究为rAAV质量标准的建立提供了一种新的思路.

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